ЗРЕЛЫЕ И НЕЗРЕЛЫЕ ГИПЕРТРОФИЧЕСКИЕ РУБЦЫ ГОЛОВЫ И ШЕИ: КЛИНИКО-МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ, ПАТОГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА

Аннотация: Целью исследования явилось изучение клинико-морфологических и патогенетических особенностей зрелых и незрелых гипертрофических рубцов (ГР) головы и шеи. Материалы и методы: проведено открытое контролируемое проспективное одноцентровое исследование 176 пациентов с биопсией рубцовой ткани. Для иммуногистохимических исследований (ИГХ) в качестве первичных антител использовали мышиные моноклональные антитела к коллагену I типа (клон 3G3, Santa Cruz, разведение 1:100), коллагену III типа (клон B-4, Santa Cruz, разведение 1:50), коллагену IV типа (клон COL-94, Santa Cruz, разведение 1:50), MMP-1 (клон 3B6, Santa Cruz, разведение 1:100), SMA (клон 1A4, Dako Agilent, разведение 1:100) и TGFβ (клон 3С11, Santa Cruz, разведение 1:100). В работе продемонстрированы отличительные клинические, морфологические и иммуногистохимические характеристики, особенности патогенеза зрелых и незрелых гипертрофических рубцов области головы и шеи.  Выявлены отличия зрелых и незрелых ГР по накоплению коллагенов, миофибробластических элементов- α-SMA, TGF-b, ММР1 макрофагов. В незрелых ГР отмечалась более высокая экспрессия TGF-b и выраженная воспалительная реакция с активным неоангиогенезом. Установлено влияние TGF-b на формирование ГР. Проведенное исследование позволяет увидеть целостную картину выявленной патологии и подобрать соответствующее лечение пациентам с ГР.

Ключевые слова: келоидные рубцы, голова и шея, иммуногистохимия, коллаген, TGF-, MMP1, SMA, ангиогенез, остеокласты, миофибробласты

The aim of the article was to study the clinical, morphological and pathogenetic features of mature and immature hypertrophic scars (HS) of the head and neck. Materials and methods: an open controlled prospective single-center study of 176 patients with scar tissue biopsy was conducted. For immunohistochemical studies (IHC), mouse monoclonal antibodies to type I collagen (clone 3G3, Santa Cruz, dilution 1:100), type III collagen (clone B-4, Santa Cruz, dilution 1:50), type IV collagen (clone COL-94, Santa Cruz) were used as primary antibodies, breeding 1:50), MMP-1 (clone 3B6, Santa Cruz, breeding 1:100), SMA (clone 1A4, Dako Agilent, breeding 1:100) and TGFß (clone 3C11, Santa Cruz, breeding 1:100). The study demonstrates distinctive clinical, morphological and immunohistochemical characteristics, features of the pathogenesis of mature and immature hypertrophic scars of the head and neck. Differences between mature and immature HS in the accumulation of collagens, myofibroblastic elements, α-SMA, TGF-b, MMP1 macrophages were revealed. In immature HS, there was a high expression of TGF-b, a more pronounced inflammatory reaction with active neoangiogenesis. The effect of TGF-b on the formation of HR has been established. The conducted study allows us to see a complete picture of the revealed pathology and to choose the appropriate treatment for patients with GR.

Keywords: Hypertrophic scar deformities, head and neck, immunohistochemistry of collagens, TGF-, MMP1, SMA, angiogenesis, myofibroblast

Введение. По данным ВОЗ, только после травм и хирургических вмешательств более чем у 100 млн. пациентов остаются рубцы разной площади и локализации [1-2]. При этом, особый интерес вызывают гипертрофические рубцы (ГР) в области головы и шеи, которые приводят не только к эстетической неудовлетворенности внешним видом, но и нарушению функции органов. Современные возможности пластической хирургии позволяют восстановить ряд эстетических и функциональных нарушений. Применение современных методик диагностики с установлением механизмов патогенеза может служить основой для пересмотра традиционно сложившихся методов лечения [3,4].

Таким образом, в диагностике завершенности процесса формирования ГР мягких тканей большую роль играют молекулярно- биологические и структурные маркеры рубцовой ткани, которые могут быть отслежены с помощью гистологических и иммуногистохимических методов. Только благодаря клинико-морфологическому анализу с оценкой гистологических и иммуногистохимических значений можно подобрать корректное лечение на разных сроках формирования рубцовой ткани ГР. Материалы и методы. Целью исследования явилось изучение клинико-морфологических и патогенетических особенностей зрелых и незрелых ГР головы и шеи.

Пациенты. Дизайн исследования – открытое контролируемое проспективное одноцентровое исследование 176 пациентов женского (114 (64,7%)) и мужского пола (62 пациента (35,2%)) с ГР поражениями головы и шеи (рис.1).

Длительность заболевания составляла от 1 месяца до 2 лет. Рубцы имели площадь 1—12 см². Распределение локализации очага у пациентов с ГР в области головы и шеи представлены в таблице №1. Критерии соответствия: Критериями включения в исследование являлось диагностированный ГР, возраст 18-70 лет. Критерии исключения: другие хирургические патологии, возраст моложе 18 и старше 70 лет. Диагноз рубцового поражения устанавливался на основании анамнеза заболевания, клинических проявлений (визуальный осмотр и пальпация), биопсии рубца с последующим патоморфологическим и ИГХ исследованиями.

2.2. Морфологические методы:

Гистологический метод. Биопсии фиксировались в 10% забуференном формалине и обрабатывались по стандартным протоколам с окраской парафиновых срезов толщиной 4 мкм гематоксилином и эозином и по Ван Гизону [5].

Оценка гистологических изменений: выраженности склероза, гиалиноза, воспалительной реакции, неоангиогенеза, а также степени отграничения рубцовой ткани осуществлялась полуколичественно от 2 до 6 баллов: низкая – 2 балла, умеренная – 4, высокая – 6 баллов. Количество миофибробластических элементов рассчитывалась в процентах на 300 клеток рубцовой ткани.

Иммуногистохимический метод (ИГХ). Для ИГХ исследования изготавливались серийные парафиновые срезы толщиной 4 мкм, расположенные на стеклах, покрытых полилизиновым слоем (Menzel Glаser Polylisine, Германия). Реакции проводились в соответствии с международными рекомендациями [6]. В качестве первичных использовались мышиные моноклональные антитела  к коллагену I типа (клон 3G3, Santa Cruz, разведение 1:100), коллагену III типа (клон B-4, Santa Cruz, разведение 1:50), коллагену IV типа (клон COL-94, Santa Cruz, разведение 1:50), MMP-1 (клон 3B6, Santa Cruz, разведение 1:100), SMA (клон 1A4, Dako Agilent, разведение 1:100) и TGFβ (клон 3С11, Santa Cruz, разведение 1:100). В качестве системы детекции применялась универсальная полимерная система Histofine® Simple Stain MAXPO (MULTI) (Nichirei, Япония). Ставили положительные и отрицательные контроли.

Результаты ИГХ реакций оценивались в баллах (от 2 до 6) по выраженности экспрессии или площади распространения для коллагенов (S£ 10% — 2 балла; S£  40% — 4 балла; S ³40% — 6 баллов).

Статистический анализ. Результаты исследования были статистически обработаны (программа STATISTICA 8 и GraphPad Prism 8). Статистически значимыми различия считали при значении р-value менее 0,05.

Результаты исследования и их обсуждение. Клинический анализ материала показал, что количество женщин в 1,8 раз превышало пациентов мужского пола. Пациенты обращались с рубцами в большинстве случаев в течение первого года. Так локализация ГР в большинстве случаев приходится на область верхней/нижней губы и угла рта (15,9%), шеи (14,2%), параорбитальной и околоушной области (13,1%), что соответствует данным литературы [7].Гистологическое исследование гипертрофических рубцов. При микроскопическом исследовании ГР установлено, что особенностью их структуры является массивное образование соединительной ткани с вихревой и кольцевидной укладкой, нередко – с формированием узлов, выступающее над поверхностью кожи.  ГР не отграничены от сохранной соединительной ткани и распространяются вокруг сосудов, придатков кожи, очагов жировой ткани. Часто встречаются очаговые воспалительные лимфомакрофагальные инфильтраты, пучки миофибробластов и сосуды капиллярного типа (Рис.2, табл.2).

При ИГХ и гистологическом исследованиях среди пациентов с ГР зрелые были у 108 пациентов (61,4%), незрелые у 68 пациентов (38,6%).

Незрелые ГР, существовавшие меньше года отличались более выраженной воспалительной реакцией, большим количеством миофибробластов и сосудов капиллярного типа (Рис.2с, табл. 2).

ИГХ характеристика ГР также зависела от степени зрелости (таб.3). В зрелых ГР преобладал коллаген 1 типа. Эластика сохранялась. Экспрессия ММР1 не определялась. Определялись более 40% a-SMA положительные миофибробласты среди клеток инфильтрата, отсутствие продукции ММР1 макрофагами и умеренный уровень продукции TGF-b макрофагами и миофибробластами (рис. 3е,f).

В незрелых ГР преобладание коллагена 1 было не столь выражено и составляло К1/К3= 6:3,1 (рис.3b), а К1/К4=6:2 (рис.3a,d). Эластика сохранялась (рис.3с). Более 40% a-SMA положительные миофибробласты среди клеток инфильтрата, высокая продукция ММР1 макрофагами и остеокластами, низкий уровень продукции TGF-b макрофагами и миофибробластами (рис. 3 d,e,f).

Заключение. При проведении данного исследования нами были выявлены диагностически значимые отличия между зрелыми и незрелыми ГР, что отражает особенности процессов неполной репарации тканей при их образовании.

Отличительной чертой ГР является инфильтрирующий характер распространения рубцовой ткани с обрастанием предсуществующих структур (сосуды, придатки кожи), соотношением коллагена 1 и 3 типа равным 1,6 в зрелых, а в незрелых равного 1 за счет значительного содержания в них коллагена 3 типа, а также сохранением эластических волокон и  миофибробластов не только на стадии созревании рубцовой ткани, но и в зрелых рубцах.

В формировании ГР участвует TGF-β, а также MMP1, которая продуцируется только на стадии незрелости макрофагами. Описанные характеристики ГР указывают на особенности патогенетических механизмов в формировании рубцовых деформаций. Проведенное исследование показало, что в формировании ГР активное участие принимает TGF-b, стимулирующий процессы склероза. Незрелые ГР отличаются от зрелых более выраженным накоплением коллагена 3 типа и активностью ММР1 в макрофагах. При этом, миофибробластические элементы α-SMA+ обнаруживаются практически в одинаковом количестве как в незрелых, так и в зрелых рубцах, что может свидетельствовать о персистенции процессов репарации в зрелых ГР.

Морфологические и ИГХ отличия ГР отражают генетические и эпигенетические особенности, а также реактивность макроорганизма, определяющие характер репаративных процессов в тканях, а кроме того во многом связаны с локализацией раневого процесса, характером и силой действия повреждающего фактора.

При исследовании ГР было обнаружено, что длительное заживление раны обусловлено гиперактивацией воспалительных процессов, ведущей к неполной репарации [8-10]. Установлены большие различия в дермальной сосудистой сети рубцовой ткани на разных стадиях развития по сравнению со здоровой кожей. В раннюю фазу заживления в стадии формирования гипертрофического рубца суммарная площадь поперечного сечения сосудов сосочкового слоя увеличивается за счет расширения просвета сосудов, а не их увеличения [11,12].  Обсуждается роль трансформирующего фактора роста (TGFβ), который регулирует пролиферацию, дифференцировку, апоптоз, адгезию и миграцию различных клеток, и играет важную роль в склеротических изменениях при формировании кожных рубцов [13,14]. Изучены механизмы формирования рубцовой ткани миофибробластами, которые в результате хронического воспаления при постоянном механическом стрессе в ткани гиперактивизируются, что также может приводить к нарушениям нормального процесса репарации.Сравнительный клинико-морфологический анализ ГР по нашим данным и данным литературы позволяет нам выдвинуть гипотезу их патогенеза (рис.4).

Раневой процесс с воспалительной реакцией приводит к активации миофибробластов, продуцирующих TGF-β. При развитии склеротических изменений накапливаются коллагены с незначительным преобладанием коллагена 1 типа над 3 типом. Не эффективность продукции MMP1 макрофагами заканчивается формированием ГР.

Заключение. Зрелые и незрелые ГР имеют отличающиеся патогенез, морфологические, иммуногистохимические характеристики. Патогенез ГР отличается продукцией TGF-β макрофагами и миофибробластами, участвующими в регуляции репаративных процессов в ходе заживления раны, и развитием склеротических изменений с накоплением коллагенов, с гораздо преобладанием коллагена 1 типа над 3 типом. Неэффективность продукции MMP1 макрофагами заканчивается формированием  гипертрофического рубца. Результаты комплексного исследования клинико-морфологического и ИГХ особенностей исследования рубцовой ткани позволяют точно верифицировать тип рубца, его стадию развития и степень зрелости. Кроме того, выраженность воспалительной реакции и ангиогенеза, а также особенности накопления коллагена, эластики, матриксной металлопротеиназы, TGF-β в рубцовой ткани может быть положено в основу разработки новых методов патогенетической терапии

Конфликты интересов: авторы не объявляют заявляют об отсутствии конфликта интересов.