Иммуногистохимические, ультраструктурные особенности эпителия и собственной пластинки десны у лиц молодого возраста с сопутствующей дисплазией соединительной ткани

Цель исследования. Определить патогенетически значимые иммуногистохимические, морфологические особенности в эпителии и собственной пластинки десны у пациентов с сопутствующей дисплазией соеди- нительной ткани (ДСТ).
Материалы и методы. Материалом для гистологических, иммуногистохимических (ИГХ) исследований послужили биоптаты десны, полученные иглами для Punch-биопсии. По результатам клинико-инстру- ментального, стоматологического обследования пациенты (n=60) в возрасте 18-25 лет с интактным пародонтом распределены на две группы. Основная группа – лица (n=30) с аномалиями окклюзии и умеренной, выраженной степенью недифференцированной дисплазии соединительной ткани (НДСТ), контрольная группа – лица (n=30) с физиологической окклюзией без признаков НДСТ. Биопсийный материал подвергался морфологическому исследованию: окрашивание гематоксилином и эозином, полихромным толуидиновым синим, реактивом Picro-Sirius Red Stain Kit; проводились ИГХ реакции к первичным антителам Ki-67, p53, Е-кадгерин, VEGFR-3, CD68. При анализе распределения коллагена I и III типов использован метод поляризационной микроскопии. Морфометрические измерения выполняли на фотоизображениях в программе ImageJ 1.47i.
Результаты. Данные исследований установили наличие морфологических изменений в эпителии и в собственной пластинке десны у людей с интактным пародонтом и сопутствующей НДСТ. У пациентов основной группы в сопоставлении с контрольной группой выявлена разнонаправленная динамика коли- чественных изменений в структурах десны (по Ме) – сокращение количества фибробластов (в 1,19 раза, р≤0,05), лимфатических сосудов с позитивным окрашиванием на VEGFR-3 (в 1,16 раза, р≤0,05), доли Ki-67+ эпителиоцитов (в 1,11 раза, р≥0,05), доли Ki-67+ фибробластов (в 1,36 раза, р≤0,05), соотношения коллагена I/III (в 1,51 раза, р≤0,05) при увеличении числа лаброцитов (в 1,65 раза, р≤0,05), доли р-53+ эпителиоцитов (в 1,45 раза, р≤0,05), доли р-53+ фибробластов (в 1,68 раза, р≤0,05). Достоверные различия (р≤0,05) между числом CD68+ макрофагов в группах отсутствуют. Результаты качественной оценки клеточной адгезии демонстрируют сокращение в 1,86-2,0 раза (р≤0,05) числа пациентов с «умеренным» окрашиванием на Е- кадгерин в базальном и в шиповатом слоях в основной группе, что указывает на ослабление межклеточных взаимодействий в ростковых слоях десневого эпителия у людей с НДСТ.
Заключение. Интерпретация результатов гистологических, ИГХ исследований выявила наличие дина- мических изменений количественного состава макрофагов (CD68+), лимфатических сосудов (VEGFR-3+), адипоцитов, качественных межклеточных контактов, пролиферативной активности эпителиоцитов и фи- бробластов, а также соотношения коллагена I/III, что расширяет научные знания об организации структур в многослойном плоском эпителии и собственной пластинки десны у пациентов с синдромом НДСТ. Достоверное (р≤0,05) сокращение пролиферативной активности фибробластов, количества лимфатических сосудов с позитивным окрашиванием на VEGFR-3, интенсивности экспрессии белка клеточной адгезии Е-кадгерина в сочетании с приростом экспрессии белка p53 и числа адипоцитов является ключевыми звеньями механизма сокращения общего количества фибробластов в эпителии и собственной пластинки десны, что определяет снижение регенераторного потенциала у лиц с НДСТ.
Ключевые слова: дисплазия соединительной ткани, иммуногистохимические маркеры, морфология, уровень экспрессии, E-кадгерин, коллаген I и III типов
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Финансирование. Работа выполнена без спонсорской поддержки.

Aim of study. The aim of this study was to identify pathogenetically meaningful immunohistochemical and morphological features in the gingival epithelium and lamina propria in patients suffering from concomitant connective tissue dysplasia (CTD).
Materials and methods. The material for histological and immunohistochemical (IHC) studies were gingival biopsies obtained with punch biopsy needles. In view of the clinical, instrumental, and dental examination data, the patients (n=60; age – 18-25) with intact periodontium were divided into two groups where the main group were individuals (n=30) with malocclusions and moderate to severe undifferentiated connective tissue dysplasia (UCTD), while the control group included individuals (n=30) with physiological occlusion and featuring no UCTD signs. The biopsy material was used for morphological examination, namely, staining with hematoxylin and eosin, polychrome toluidine blue, and Picro-Sirius Red Stain Kit; IHC reactions were performed with primary antibodies to Ki-67, p53, E-cadherin, VEGFR-3, and CD68. The distribution of Type I and Type III collagen was analyzed with polarized light microscopy. Morphometric measurements were performed on photographic images employing ImageJ 1.47i software.
Results. The data obtained through the study pointed at morphological changes involving the epithelium and lamina propria of the gingiva in individuals with intact periodontium and concomitant UCTD. In the main group – as compared to the control group – multi-vector dynamics of quantitative changes in the gingival structures was detected (by Me): a decrease in the number of fibroblasts (1.19 times, p≤0.05); lymphatic vessels with positive staining for VEGFR-3 (1.16 times, p≤0.05); the share of Ki-67+ epithelial cells (1.11 times, p≥0.05); the share of Ki-67+ fibroblasts (1.36 times, p≤0.05), as well as Type I/III collagen ratio (1.51 times, p≤0.05), with an increase in the number of labrocytes (1.65 times, p≤0.05); the share of p-53+ epithelial cells (1.45 times, p≤0.05), and the share of p-53+ fibroblasts (1.68 times, p≤0.05). No significant differences (p≤0.05) were identified between the number of CD68+ macrophages in the groups. The data obtained through the qualitative assessment of cell adhesion demonstrate a decrease (1.86-2.0 times; p≤0.05) in the number of patients with «moderate» staining for E-cadherin in the basal and spinous layers in the main group, which is indicative of a weakening intercellular interaction in the germinative layers of the gingival epithelium in individuals with UCTD.
Conclusion. Interpretation of the results of histological and IHC studies revealed dynamic changes in the quantitative composition of macrophages (CD68+), lymphatic vessels (VEGFR-3+), adipocytes, qualitative intercellular contacts, proliferative activity of epithelial cells and fibroblasts, as well as Type I/III collagen ratio, which expands scientific knowledge regarding the structural arrangement in the stratified squamous epithelium and lamina propria of the gingiva in patients with UCTD syndrome. A significant (p≤0.05) reduction affecting the proliferative activity of fibroblasts, the number of lymphatic vessels with positive staining for VEGFR-3, and the intensity of E-cadherin cell adhesion protein expression, combined with an increase in p53 protein expression as well as in the number of adipocytes, serve key links in the mechanism of reducing the total number of fibroblasts in the gingival epithelium and lamina propria, which stands behind the decrease in regenerative potential in individuals with UCTD.
Keywords: connective tissue dysplasia, immunohistochemical markers, morphology, expression level, E-cadherin, Type I and III collagen
Conflicts of interest. The author have no conflicts of interest to declare.
Funding. There was no funding for this study.

Введение
Согласно современных представлений, ДСТ – патологическое состояние соединительной ткани (СТ), вызванное генетически детерминированным нарушением её развития в эмбриональном и постнатальном периодах, морфологической основой которых являются дефекты строения коллагена, преимущественно IV-VII типов. Дефекты волокнистых структур / основного вещества СТ, обусловленные морфофункциональными, метаболическими расстройствами дифференцировки компонентов экстрацеллю- лярного матрикса с дисбалансом между деградацией и синтезом его компонентов, приводят к нарушению формообразования и физиологических функций органов и систем с последующим развитием диспластикозависимых клинических проявлений [1-3]. У пациентов с НДСТ патологические нарушения СТ реали- зуются в виде внешних проявлений в сочетании с клинически значимой дисфункцией одного / нескольких органов, при этом набор клинических признаков не укладывается ни в один из моногенных наследственных синдромов, а выраженность мор- фологических изменений, как суммарного эффекта «семей- ного накопления» диспластических нарушений на тканевом и органном уровнях, является неспецифичной и определяется вариантами дисплазий [4]. Научно-практический интерес специалистов к НДСТ, как самостоятельному синдрому полигенно-мультифакториаль- ной природы, обусловлен комплексом следующих факторов: высокой распространённостью (выявляемость отдельных при- знаков НДСТ у лиц молодого возраста составляет 14–85%); широким спектром фенотипических (внешних / висцеральных) признаков; сложностью патогенеза; полиморфной клинической симптоматикой; склонностью к прогрессирующему течению; формированием вторичных (ассоциированных) патологических состояний со стороны внутренних органов и систем, имеющих особенности течения и низкую эффективность традиционной терапии. Медико-социальная значимость НДСТ связана с появ- лением в молодом возрасте серьезных осложнений, ограничи- вающих трудовую деятельность (инвалидизация), снижающих качество жизни и негативно влияющих на прогноз жизни [5–9]. НДСТ, как наследственно обусловленная аномалия развития мезенхимального матрикса организма, приводит к снижению стабильности, устойчивости, прочности соединительной ткани. Мезенхимальное происхождение имеют структурные компо- ненты опорно-двигательной, сердечно-сосудистой, пищевари- тельной, дыхательной, нервной систем, а также органов зре- ния. Интенсивность диспластических расстройств определяется числом/видом мутаций, избирательностью поражения соедини- тельной ткани («плотная»/«рыхлая»), характером морфофунк- циональных нарушений на этапе онтогенеза. Абнормальные морфофункциональные изменения при НДСТ со стороны сое- динительнотканных структур существенным образом не влияют на деятельность организма, но вследствие неполноценности кол- лагеновых и эластических волокон способны оказать модифици- рующее воздействие на протекание большинства патологических процессов, в том числе и в кранио-фациальной области [10–14]. Выраженные поражения при НДСТ претерпевают органы и системы с высоким содержанием коллагена. У пациентов с НДСТ структуры кранио-фациальной области, образованные соединительной тканью, вовлечены в патологические механиз- мы, результатом которых является формирование врождённых аномалий, нарушений (острых / хронических) кровообращения, функциональных расстройств, предопределяя особенности HEAD AND NECK RUSSIAN JOURNAL Vol 14, №2 – 2026 ORIGINAL RESEARCH ARTICLES 59 течения адаптационных и воспалительно-деструктивных реакций при стоматологических заболеваниях. В научной литературе представлены убедительные сведения о высокой выявляемости у больных с НДСТ зубочелюстных аномалий / деформаций, дис- функций ВНЧС, пародонтопатий, множественного кариеса зубов, заболеваний СОПР, аномалий прорезывания зубов [15–19]. Авторами доказано, что при разработке персонифициро- ванных программ стоматологической реабилитации пациентов с НДСТ целесообразно учитывать следующие особенности: высокий риск развития осложнений из-за предрасположенно- сти к геморрагиям / гипертрофическому рубцеванию; наличие нарушений костного формообразования и замедленной кон- солидации отломков; вероятность повреждении капсулярно- связочного аппарата ВНЧС; «незрелость» пучков коллагеновых волокон в структурах периодонта [20–23]. Несмотря на большое число научных публикаций по проблеме НДСТ исследования, посвящённые изучению закономерностей и особенностей структурной организации слизистой оболочки десны у лиц молодого возраста с диспластическими фенотипа- ми единичны и носят разрозненный характер [24]. В современной медицине ИГХ методы, позволяющие выявлять точную локализацию клеточного / тканевого антигена с еди- новременным иммунологическим анализом клеток / тканей при сохранении морфологии изучаемых объектов, являются одними из превалирующих в изучении морфофизиологиче- ских, патологоанатомических, онкоморфологических и био- логических аспектов жизнедеятельности организмов [25–27]. Использование морфологических, ИГХ методов у пациентов с НДСТ позволит изучить состояние межклеточных контактов, количественно установить превалирование пролиферативной или апоптотической клеточной активности в эпителии / соедини- тельнотканных структурах десны, а также выявить особенности распределения коллагена I и III типов. Полученные результаты расширят представления о характере компенсаторно-приспосо- бительных механизмов у лиц с НДСТ, выявят информативные клеточные признаки, ассоциированные с диспластическими фенотипами, оценка которых позволит стратифицировать паци- ентов на группы риска, а также будет способствовать разработке эффективных лечебных программ, ориентированных на коррек- цию выявленных диспластических нарушений. Цель исследования: определить патогенетически значимые иммуногистохимические, морфологические особенности в эпи- телии и собственной пластинки десны у пациентов с сопутст- вующей ДСТ. Материалы и методы На базе кафедры стоматологии общей практики и детской стоматологии ФГБОУ ВО «СтГМУ», судебно-гистологического отделения ГБУЗ СК «Краевое бюро судебно-медицинской экс- пертизы» проведены клинические, параклинические исследо- вания 30 пациентов (мужчин – n=12; 40,0%, женщин – n=18; 60,0%) с аномалиями окклюзии и фенотипическими призна- ками НДСТ, из которых была сформирована основная группа. Тип исследования: открытое, когортное, поперечное, проспек- тивное. Клинико-инструментальное обследование на предмет выявления фенотипических маркеров (внешних/висцеральных) дисэмбриогенеза проводилось в соответствии с разработан- ным комитетом экспертов ВНОК Российских рекомендаций «Наследственные нарушения соединительной ткани» (2012). Степень выраженности диспластических нарушений оценивали по диагностическим критериям Т. Милковска-Димитровой и поведения и психические расстройства (рис. 1, 2). Контрольную А. Каркашова (1987) и балльной шкале значимости клинических группу составили 30 добровольцев (мужчин – n=14; 46,7%, жен- маркеров НДСТ Т.И. Кадуриной (2008). Верификация диагноза щин – n=16; 53,3%) 18–25 лет (средний возраст – 21,1±1,3 лет) НДСТ по совокупности комплекса клинико-инструментальных, г/d д/e е/f с интактным пародонтом, хорошим уровнем оральной гигиены, лабораторных обследований проводилась в кардиологическом физиологическими видами прикуса без фенотипических при- отделении ГБУЗ СК «КККД». Исследования выполнены в соот- знаков НДСТ. ветствии с Хельсинкской Декларацией Всемирной Медицинской Для проведения морфологических методов (гистологиче- Ассоциации (принята на 18-й Ассамблее ВМА в Хельсинки в июне ский, иммуногистохимический, поляризационной микроскопии) 1964 г., последняя редакция утверждена на 64-й Ассамблее в исследований у лиц основной группы биопсийный материал г. Форталеза в октябре 2013 г.), Правилами Надлежащей десны получали стерильными одноразовыми иглами-стилетами Клинической Практике (ICH GCP), требованиями, представлен- (Ø=2мм) для дермальной Punch-биопсии («Sterylab») на этапе ными в законодательстве РФ (Национальный стандарт ГОСТ экстракции зубов по ортодонтическим показаниям, у пациентов Р52379-2005; Приказ Минздрава РФ от 29.11. 2012 года № 986н; контрольной группы – в области непрорезавшихся зубов мудро- Приказ Минздрава РФ от 19.06.2003 № 266). В основную группу сти после обработки раствором антисептика и проводниковой включены пациенты с «умеренной», «выраженной» степенью анестезии «Ultracain®D» (рис. 3). НДСТ (три и более «главных», два и более «второстепенных» при- Биопсийный материал (0,2×0,2 см) при t=21–24°С на протя- знаков по критериям Т. Милковска-Димитровой; более 21 балла жении 24 часов фиксировали в 10% забуференном р-ре форма- по шкале Т.И. Кадуриной). Критерии включения: лица мужского/ лина (pH=7,2-7,4). В лаборатории биоптаты после проводки на женского полов в возрасте 18-25 лет (средний возраст – 20,4±1,6 гистопроцессоре карусельного типа «STP 120» («Thermo Fisher лет); подтверждённый симптомокомплекс НДСТ; вертикальные, Scientific Inc.») заливали в парафин в модульной гистологиче- сагиттальные, трансверсальные аномалии окклюзии; клиниче- ской системе заливки «EC 350» («Especialidades Medicas Myr ски здоровый пародонт; санированная полость рта; хороший SL»). Изготовленные с помощью микротома «Microm HM 325» уровень гигиены; согласие на обработку персональных данных; («Thermo Fisher Scientific Inc.») срезы (толщина 5μ) фиксировали наличие информированного согласия на участие в исследова- на поли-L-лизиновые стекла и далее высушивали в течение нии. Критерии исключения: возраст моложе 18 и старше 25 лет; 24 часов при комнатной температуре. беременность/лактация; травмы и врождённые пороки развития Гистологические методы. На приготовленных препаратах кранио-фациальной области; хронические заболевания СОПР; (обзорная окраска гематоксилином и эозином) ядра фибро- заболевания пародонта воспалительного, дистрофического, бластов окрашены в фиолетовый цвет, межклеточное вещество идиопатического, неопластического характера; проведённая (тканевой матрикс) собственной пластинки десны и клеточ- ранее ортодонтическая коррекция; наличие моногенно наследу- ная цитоплазма – в розовый цвет. Для количественной оцен- емых синдромов поражения СТ (Syndrom Ehlers-Danlos, Syndrom ки популяции лаброцитов в соединительнотканной пластинке Marfan, Osteogenesis imperfecta, MASS-фенотип и др.); наличие десны выполняли дополнительное окрашивание полихромным общесоматических заболеваний в «острой» фазе и хрониче- толуидиновым синим (метод P.G. Unna). Специфичные морфо- ской патологии в фазе обострения/декомпенсации; расстройства логические признаки лаброцитов: крупные размеры, овальная форма, обильная метахроматическая зернистость в цитоплазме, – г/d д/e е/f кодируемый геном CDH1 кадгерин I типа E-кадгерин, как умеренное развитие аппарата Гольджи, большое число микро- ключевая гомофильная молекула клеточной адгезии, обеспе- ворсинок по периферии клетки, ядро овальное / светлое. Из-за чивает целостность эпителиального пласта за счёт образова- содержания гепарина, гистамина, вазоактивного интестиналь- ния межклеточных контактов сцепляющего типа (десмосом), ного пептида, гранулы окрашиваются в фиолетовый, голубой, защищает клетки эпителиальной ткани от апоптоза путём фиолетово-красный цвет. регуляции процессов пролиферации, дифференцировки Иммуногистохимические (ИГХ) методы выявляют точную и поляризации. Для детекции Е-кадгерин позитивных эпите- локализацию антигена (клеточного/тканевого) благодаря его лиоцитов использовали моноклональные мышиные антитела связыванию с маркированными специфическими антителами. к E-cadherin (Clone SMP471) («Diagnostic BioSystems») в раз- Для ИГХ исследований биоптаты после фиксации (формалин – ведении 1:30. Контакты между эпителиальными клетками 10,0 % нейтральный забуференный; 24 часа) заливали в пара- окрашивались в коричневый цвет разной интенсивности. фин с последующим изготовлением срезов (толщина 4μ). Срезы Качественный анализ экспрессии Е-кадгерина выполняли наносили на поли-L-лизиновые стекла и высушивали 18 часов с учётом степени окрашивания плазмолемм по критериям: при +37°С. Для визуализации антигенов (Ki-67, p53, Е-кадгерин, окрашивание отсутствует – «0 баллов»; слабое окрашивание – VEGFR-3, CD68) применяли систему QUANTO на основе перок- «1 балл»; умеренное окрашивание – «2 балла»; интенсивное сидазы хрена и диаминобензидина. ИГХ окрашивание (одинар- окрашивание – «3 балла»; ное/двойное) выполнялось на полностью автоматизированном Bond™-maX модуле («Leica Biosystems»), для детекции приме- няли системы Bond Polymer Refine Detection (protocol F) и Bond Polymer Refine Red Detection (protocol J) («Leica Biosystems»). Докрашивание срезов осуществляли гематоксилином Майера. В ИГХ исследовании использованы следующие антитела: – Ki-67 – ядерный белок, связанный с клеточной пролифера- цией и транскрипцией рибосомальной РНК. Для определения Ki-67 позитивных эпителиоцитов и фибробластов применяли моноклональные кроличьи антитела к Ki-67 (Clone SP6) («Cell Marque») с окрашиванием клеток в коричневый цвет; – белок р53 (транскрипционный фактор), выполняющий супрес- сорную функцию (апоптоз, остановка клеточного цикла, репа- рация ДНК). Для детекции р53-позитивных эпителиоцитов и фибробластов использовали моноклональные антитела к р53 (CloneAb-5(DO-7)) («LabVision») в разведении 1:100 с окрашиванием клеток в коричневый цвет; – основной митогенный рецептор лимфатического эндоте- лия VEGFR-3 является трансмембранным гликопротеидом, регулирующим лимфангиогенез, а его активация приводит к пролиферации, дифференцировке и миграции лимфати- ческих эндотелиоцитов. Для детекции VEGFR-3 позитивных эндотелиоцитов лимфатических сосудов применяли мыши- ные антитела против антигена VEGFR-3 (Clone D-6) («Santa Cruz Biotechnology») в разведении 1:200. Эндотелиоциты лимфатических сосудов, иммунопозитивных к VEGFR-3, окра- шивались в коричневый цвет; – CD68 (макросиалин), как трансмембранный гликопротеин I типа из семейства LAMP, принимает непосредственное участие в фагоцитарной активности тканевых макрофа- гов, во внутриклеточном лизосомальном метаболизме и во внеклеточных взаимодействиях «клетка-клетка» / «клетка- патоген», имеет способность к связыванию с селектинами / лектинами, а также возможность рециркуляции между лизосомами и эндосомами. Для детекции CD68 позитивных клеток использовали первичные моноклональные антитела к антигенному маркеру CD68 (CloneKP1) («Dako») в разведении 1:50. Результатом позитивной ИГХ-реакции на CD68 являлось окрашивание макрофагов в коричневый цвет, негативной ИГХ-реакции – отсутствие окрашивания. Метод поляризационной микроскопии применяли для установ- ления степени зрелости («созревания») соединительной ткани десны путём оценки соотношения коллагена I типа к коллагену III типа (I/III) в соединительной ткани десны с использованием набо- ра реактивов Picro-Sirius Red Stain Kit (Connective Tissue Stain). На первом этапе срезы (толщина 5μ) погружали на 30 минут в р-р «Picro Sirius» (0,1% р-р Sirius Red F3BA + пикриновая к-та; рН=2). Второй этап включал промывание срезов в течение 2 минут 0,01% р-ром NHCl с последующей дегидратацией и помещением в синтетическую монтирующую среду «Bio-Mount» («Bio Optica Milano S.P.A.»). При проведении количественного морфометри- ческого анализа препаратов использовали световой микроскоп «Carl Zeiss Axio Lab.A1» с камерой «ZEISS Axiocam 208 color», микроскоп «Leica DM3000 LED» с камерой «Leica DFC 425» («LEICA Microsystems»), систему анализа («HIPLAN 20x/0.10») с возможностью получения фотоизображений (JPEG), программу обработки графических файлов ImageJ 1.47i (US National Institutes of Health). Для оценки экспрессии антигена на каждом образце при увеличении ×400 изучали не менее 10 случайно выбранных областей интереса (размер 100×100 pixels) и для каждого слайда рассчитывали среднюю величину изучаемых признаков. В десневом эпителии на 100 клеток базального, шипова- того слоёв определяли численность позитивных Ki-67 и p53 эпителиоцитов, а также долю Ki-67+ и p53+ эпителиоцитов в данном поле зрения. В собственной пластинке слизистой оболочки десны устанавливали общее количество фибробла- стов (×400) и долю позитивных Ki-67 и p53 фибробластов в данном поле зрения, а также определяли долю фибробластов с позитивной реакцией на одно поле зрения. Количественно определяли фибробласты, лаброциты, CD68 макрофаги, лим- фатические сосуды на 1 мм2 ткани десны (среза) при ×400. Для морфометрической оценки результатов поляризационной микроскопии в цветных гистограммах рассчитывали площадь красных и зелёных пикселей. Исходное сопоставление площади красных и зелёных пикселей соответствовало соотношению между I (зрелым) и III (незрелым) типами коллагена (I / III). Статистическую обработку проводили в программе Statistical Package for the Social Science 16.0 (SPSS, USA). Для провер- ки соответствия анализируемых данных закону нормального распределения применяли Shapiro-Wilk’s W test. Для коли- чественных непрерывных показателей при нормальном рас- пределении производился расчет средних значений и стан- дартного отклонения с представлением в формате М±SD. При отсутствии нормального распределения рассчитывали медиану (Ме), минимальное (Min), максимальное (Max) значения, 10-й, 25-й (Q1), 75-й (Q3), 90-й перцентили. Рассчитывали критерий Краскела-Уоллиса (Kruskal-Wallis test) для независимых выборок с поправкой Бонферрони (Bonferroni correction) для определения значимых различий в числовых величинах между группами. Статистическая значимость различий между выборками при- нималась за достоверную при показателях p≤0,05. Результаты исследования Данные изучения количественного состава клеточной попу- ляции и лимфатических сосудов многослойного плоского эпи- телия, собственной пластинки десны у пациентов контрольной, основной групп по результатам гистологических, морфометри- ческих и иммуногистохимических исследований представлены в табл. 1,2. По результатам гистологических исследований биоптатов в обеих группах установлено, что для участвующих в форми- ровании волокон соединительной ткани и синтезе межклеточ- ного вещества фибробластов собственной пластинки десны специфичны следующие морфологические признаки: звёзд- чатая / веретенообразная форма; овальное ядро с одним или несколькими ядрышками; незначительный объём цитоплазмы с развитой эндоплазматической сетью с рибосомами, большим количеством митохондрий, увеличенными размерами аппарата Гольджи. В биоптатах десны пациентов контрольной и основной групп отмечается равномерность распределения фибробластов, как в сосочковом, так и в сетчатом слоях собственной пластинки десны. Количественная оценка (по Ме) данных микроскопии ука- зывает, что в образцах десны пациентов с внешними стигмами НДСТ (рис. 4-а) количество фибробластов в 1 мм2 среза собст- венной пластинки (плотность) на 16,43% (р≤0,05) меньше ана- логичных параметров, установленных у лиц без фенотипических маркеров НДСТ (рис. 4-б). Статистически значимое (р≤0,05) снижение общей численности фибробластов в собственной пластинке десны, отображающее структурно-функциональную «незрелость» развития соединительной ткани у людей с диспла- стическими фенотипами, обусловлено сокращением их проли- феративной активности. Важно отметить, что недостаточность фибробластов в сочетании с их структурно-функциональными изменениями способствует замедлению процессов восстанов- ления (регенерации) тканей пародонтального комплекса у лиц с НДСТ. Расположенные около сосудов кровеносного русла собствен- ной пластинки десны лаброциты являются многофункциональ- ными специализированными эффекторными (сигнальными) клетками врождённого иммунитета. В физиологических усло- виях лаброциты выполняют следующие функции: продукция / накопление / высвобождение биологически активных веществ; поддержание постоянства соединительной ткани; сохранение баланса сосудистого тонуса и состава белков межклеточного матрикса; участие в репаративных процессах (восстановление тканей, заживление ран, ангиогенез) и в аллергическом воспа- лении; защита от инфекционных патогенов; индукция иммуно- логической толерантности. Данные морфометрического анализа (по Ме) биоптатов десны указывают, что у лиц без фоновой соединительнотканной патологии количество лаброцитов в 1 мм2 среза собственной пластинки десны составляет 100,73 (рис. 5-а). У пациентов с внешними признаками синдрома НДСТ численность лаброцитов в соединительнотканном компоненте десны (по Ме) приравнена к 166,27 на 1 мм2 среза, что на 65,07% выше (р≤0,05) по отношению к показателям людей контрольной группы (рис. 5-б). По нашему мнению, достоверный прирост (р≤0,05) лаброцитов в собственной пластинке десны у лиц с фенотипическими маркерами НДСТ связан с усилением ангио- генеза, стимуляцией процессов ремоделирования (регенерации) соединительной ткани, активизацией метаболических процессы в ответ на избыточное (внутри- / внеклеточное) накопление «незрелого» коллагена III типа. Результаты морфометрии свидетельствуют, что у лиц контр- ольной группы в 1 мм2 среза соединительнотканного компонента десны (по Ме) содержится 751,2 макрофагов с положительной экспрессией на CD68 (рис. 6-а). У пациентов основной группы число CD68+ макрофагов (по Ме) составляет 748,3 на 1 мм2 среза собственной пластинки десны, при этом разница между количественными показателями CD68+ макрофагов в исследу- вие или слабую интенсивность экспрессии (окрашивания) емых группах является статистически недостоверной (р≥0,05) VEGFR-3 (рис. 7 а-в). У людей с внешними фенотипическими (рис. 6-б). маркерами НДСТ (по Ме) установлено 1836,1 лимфатических Продуцируемый клетками сигнальный белок VEGF прини- сосудов в 1 мм2 среза биоптата десны, позитивно окрашен- мает участие в дифференцировке ангиобластов, стимулирует ных на VEGFR-3. Отмечено, что численность лимфатических образование кровеносных сосудов (васкулогенез/ангиогенез), сосудов, позитивно окрашенных на VEGFR-3 в собственной способствует усилению роста скелетных мышц, обеспечивает пластинке десны у лиц основной группы на 14,09% меньше коллатеральное кровообращение. Обладая митогенной актив- (р≤0,05) аналогичных величин людей контрольной группы, в/c г/d ностью, VEGF регулирует миграцию эндотелиоцитов, проница- а встречаемость лимфатических сосудов без окрашивания емость сосудов, индуцирует экспрессию антиапоптотических преобладает над выявляемостью сосудов со слабой выражен- белков в этих клетках. Кодируемый геном Flt-4 рецептор-3 ностью экспрессии VEGFR-3 (рис. 7-г). сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGFR-3) экс- Кодируемый геном MKI67 – Ki-67 (ядерный антиген про- прессируется в лимфатических эндотелиоцитах, участвует лиферирующих клеток) является человеческим протеином. в функционировании лимфо- и ангиогенеза, а результатом В период интерфазы Ki-67 имеет внутриядерную локализацию, активации VEGFR-3 является дифференцировка / миграция с последующим его перемещением в фазе митоза к поверхности лимфатических эндотелиоцитов, реорганизация эпителиальной хромосом. Присутствие Ki-67 во всех активных фазах клеточного ткани в трубчатые структуры (тубулогенез), пролиферация цикла (G1, S, G2, митоз), но отсутствие в покоящихся клетках в межклеточных соединениях с последующим изменением (G0), делает его оптимальным маркером клеточной пролифе- проницаемости монослоя эпителиальных клеток. По данным рации. Среди пациентов контрольной группы в биоптатах десны морфометрии у лиц без фоновой соединительнотканной пато- позитивная реакция на Ki-67 определяется (по Ме) у 28,68% логии число лимфатических сосудов с позитивным окра- эпителиоцитов базального и шиповатого слоёв (рис. 8-а). У лиц шиванием на VEGFR-3 в 1 мм2 среза собственной пластинки основной группы доля эпителиоцитов базального и шиповатого десны (по Ме) составляет 2137,4, при этом значительная часть слоёв, демонстрирующих Ki-67 положительную реакцию, при- лимфатических сосудов с эндотелиоцитами имеет отсутст- равнена (по Ме) к 25,76%, при этом разница между количест-венными показателями Ki-67+ эпителиоцитов в исследуемых 1 группах является недостоверной (р≥0,05) (рис. 8-б). Доля фибробластов с позитивной экспрессией маркера пролиферации Ki-67 в собственной пластинке десны у людей контрольной группы (по Ме) составляет 19,37% (рис. 9-а). У пациентов основной группы доля пролиферирующих фибро- бластов (по Ме) в биоптатах десны – 14,22%, что на 26,59% достоверно меньше (р≤0,05) аналогичных показателей, установ- 2 ленных у лиц контрольной группы (рис. 9-б). Значимое (р≤0,05) снижение числа фибробластов и доли Ki-67+-фибробластов у людей с фенотипическими признаками НДСТ, по отношению к лицам без соединительнотканной патологии, свидетельствует об уменьшении скорости обновления и сокращении биосин- тетической / пролиферативной активности данной клеточной популяции, нарушении динамического равновесия (дезоргани- зации) между компонентами (эластин, коллаген, протеоглика- ны, адгезивные белки) межклеточного матрикса, расстройстве процессов ремоделирования (самообновления) с последующим изменением архитектоники и замедлением регенерации слизи- стой оболочки десны. 1 Белок p53 как транскрипционный фактор, регулирующий клеточный цикл, экспрессируется во всех клетках организма. В здоровых тканях при отсутствии повреждений генетического аппарата белок р53 находится в неактивном состоянии, а корот- кий период полураспада делает его экспрессию практически незаметной. При накоплении повреждений ДНК происходит 2 экспрессия гена р53 и соответствующего протеина, который блокирует клеточный цикл в переходе из GI в S фазу, инги- бируя дальнейшую репликацию поврежденной ДНК. В случае отсутствия удаления повреждённых участков ДНК включаются другие механизмы запуска апоптоза. Данные характеристики белка р53 делают его информативным показателем, как для оценки клеточного повреждения, так и для опосредованно- го определения клеточного потенциала к запуску апоптоза. У пациентов контрольной группы (по Ме) доля р53 позитивных эпителиоцитов к общему количеству эпителиальных клеток базального и шиповатого слоёв десны составляет 12,41% (рис. 10-а). Экспрессия белка p53, как маркера каспаза-зави- симого апоптоза, в эпителиоцитах ростковой зоны десны у лиц основной группы (по Ме) – 18,03%, что на 45,29% достоверно больше (р≤0,05) аналогичных величин у людей контрольной 2 группы (рис. 10-б). По нашему мнению, значимый (р≤0,05) прирост доли эпителиоцитов базального и шиповатого слоёв, находящихся в состоянии апоптоза, обусловлен усилением процессов клеточного обновления в многослойном плоском нео- роговевающем эпителии десны у пациентов с маркерами НДСТ. Среди лиц контрольной группы (по Ме) от общего количества фибробластов собственной пластинки десны выявлено 8,19% фибробластов, иммунопозитивных к p53 (рис. 11-а). У пациентов основной группы (по Ме) доля фибробластов собственной пла- стинки десны, находящихся в состоянии апоптоза, приравнена к 13,73%, что на 67,64% достоверно больше (р≤0,05) аналогич- ных параметров у лиц контрольной группы (рис. 11-б). Можно предполагать, что значимое (р≤0,05) увеличение экспрессии p53 в фибробластах собственной пластинки десны у людей 2 с «незрелой» соединительной тканью связано с нарушением морфологии и функциональной активности экстрацеллюлярного матрикса из-за наноструктурных, морфометрических, физико- механических и конформационных изменений. Результатом 1 диспластикозависимых нарушений морфофункциональной организации соединительной ткани является снижение физи- ологического / репаративного гистогенеза десны, пролонгиро- вание процессов регенерации / ранозаживления, высокий риск формирования рубцов. Качественная оценка (интенсивность окрашивания) в межкле- точных соединениях эпителиоцитов базального и шиповатого слоёв десны по результатам иммуногистохимического окраши- вания на Е-кадгерин у пациентов контрольной, основной групп представлена в табл. 3,4. По результатам ИГХ-окрашивания многослойного плоского неороговевающего эпителия десны установлено, что у людей контрольной группы превалирует встречаемость «умеренного» окрашивания на Е-кадгерин (базальный слой – 43,4% (n=13); шиповатый слой – 46,6% (n=14)), что указывает на устойчивые межклеточные взаимодействия (контакты), как в базальном, так и в шиповатом слоях десневого эпителия (рис. 12-а). У лиц основной группы наиболее часто выявляются межклеточные взаимодействия со «слабым» окрашиванием на Е-кадгерин, как базальном (40,0% (n=12), так и в шиповатом (40,0% (n=12) слоях. Достоверное (р≤0,05) сокращение доли (1,86–2,0 раза) пациентов с «умеренным» окрашиванием на Е-кадгерин в основной группе относительно контрольной группы, указывает на ослабление межклеточных взаимодействий в ростковых слоях многослойного плоского неороговевающего десневого эпителия у лиц с диспла- стическими изменениями соединительной ткани (рис. 12-б). Величина соотношения коллагена I/III в собственной пластинке десны у пациентов исследуемых групп представлена в табл. 5. Оценка распределения коллагена I, III типов в собственной пластинке слизистой оболочки десны у людей контрольной группы по данным поляризационной микроскопии позволяет утверждать, что «зрелый» коллаген I типа с высокой степе- А 1 нью флюоресценции распределён гомогенно (равномерно), и представлен в виде «толстых», упорядоченных фибриллярных структур. В отличие от коллагена I типа, «незрелый» коллаген III типа имеет низкую степень флюоресценции, «истончённые» фибриллярные структуры, с хаотичной (апериодичной) про- странственной организацией (рис. 13-а). Данные соотношения Б 2 коллагена I/III в соединительной (плотной, рыхлой) ткани десны указывают, что в сравнении с контрольной группой, у людей основной группы величина снижения данного соотношения (по Me) составила 33,67% (р≤0,05) (рис. 13-б). Обсуждение Результаты ИГХ исследований демонстрируют наличие мор- фологических изменений в эпителии, а также соединительной ткани десны у людей с интактным пародонтом и фенотипиче- скими признаками синдрома соединительнотканной дисплазии. Результаты морфологических исследований свидетельствуют, А что по отношению к лицами без маркеров НДСТ у пациентов 1 основной группы отмечается усиленный синтез и аккумуляция «незрелого» коллагена с низкими механическими параметрами (твёрдость, прочность, пластичность), имеющего не значитель- ный диаметр коллагеновых фибрилл без структурированной Б 2 надмолекулярной пространственной организации. Следует отметить, что у лиц с проявлениями НДСТ наруше- ние морфологии собственной пластинки десны реализуется в виде низкого количественного соотношения коллагена I/III с преобладанием (накоплением) коллагена III типа, «разрыхле- ния» и дезорганизации соединительнотканных структур десны, при этом отсутствие «созревания» полноценных коллагеновых волокон сочетается с негативными качественными / количественными изменения в эластических волокнах. Нарушение распределения эластина и сокращение его содержания нега- тивно влияет на развитие сосудистого русла, что приводит к расстройству микроциркуляции в тканях пародонтального комплекса у пациентов с НДСТ. Высокая экспрессия Е-кадгерина в межклеточных соеди- нениях эпителиоцитов базального и шиповатого слоёв десны у людей с интактным пародонтом без фенотипических марке- ров НДСТ, по данным ИГХ-окрашивания, за счёт поддержания целостности эпителиального пласта сохраняет выраженные барьерные свойства десневого эпителия, обеспечивая защиту от различных (механических, физических, химических) раз- дражителей. Снижение экспрессии Е-кадгерина у лиц с кли- ническими проявлениями НДСТ запускает механизм эпители- ально-мезенхимального перехода, при котором эпителиоциты утрачивают эпителиальные характеристики (множественные межклеточные взаимодействия, апикально-базальная ориен- тация) и приобретают мезенхимальный клеточный фенотип (низкая адгезия к клеткам, высокая миграционная активность в соединительную ткань с дифференцировкой в фибробла- стоподобные клетки). Результатом изменения клеточного фенотипа на мезенхимальный, специфичного для фиброза и репаративных процессов, является реорганизация цитоске- лета эпителиоцитов, изменение состояния из адгезивного на подвижное, а также усиление уровня экспрессии кодирующих ММП генов, которые принимают участие в деградации базаль- ной мембраны и экстрацеллюлярного матрикса. Сокращение экспрессии Е-кадгерина создаёт благоприятные условия для проникновения пародонтопатогенных бактерий и их токсинов в собственную пластинку десны, разрушения десневого эпи- телиального барьера десны и развития процессов воспаления в тканях пародонта [28-29]. У лиц с системной соединительнотканной недостаточностью накопление «незрелого» коллагена обусловлено следующими факторами: «незавершённость» механизмов созревания; низкая синтетическая активность коллагена на клеточном и внеклеточ- ном уровнях; изменение цитоскелета и ингибирование клеточной пролиферации фибробластов; значительная доля фибробла- стов в собственной пластинке десны, находящихся в состоянии апоптоза; преобладание механизмов деградации над синтезом. Включение в волокнисто-сетчатую и волокнисто-параллельную организацию соединительной ткани значительной доли тон- ких / мелких, фрагментированных, хаотично расположенных фибрилл изменяет пространственную ориентацию коллагеновых волокон, что наряду с уменьшением соотношения I/III прогно- зирует, как снижение интенсивности механизмов ремодели- рования и репаративной регенерации, так и увеличение риска развития фоновой патологии, ассоциированных заболеваний, дисфункциональных нарушений в челюстно-лицевой области. При выполнении рутинных морфологических исследований использование реактивов «Picro-Sirius Red Stain Kit» и метода поляризационной микроскопии для оценки распределения кол- лагена I и III типов в соединительной ткани десны значительно повышает качество и специфичность морфологической диаг- ностики синдрома НДСТ у пациентов на стоматологическом приёме. Включение в панель для ИГХ-исследований анализа интен- сивности (степень окрашивания) экспрессии Е-кадгерина, как маркера межклеточной адгезии, расширит представления о состоянии межклеточных взаимодействий в ростковых слоях многослойного плоского неороговевающего десневого эпителия при воспалительных и воспалительно-деструктивных процессах в пародонте, а также позволит разработать патогенетически обоснованные подходы к лечению заболеваний пародонта у пациентов с сопутствующей НДСТ [30]. Сердечно-сосудистая, опорно-двигательная, пищеваритель- ная, мочевыделительная, дыхательная, нервная системы орга- низма («органы-мишени») мезенхимального происхождения являются коллагенизированными и облигатно вовлечёнными в патологический процесс у людей с синдромом НДСТ. Нарушение архитектоники соединительной ткани является основой для формирования диспластико ассоциированной патологии, а внешние и висцеральные фенотипические признаки НДСТ целесообразно рассматривать в концепции единства диспла- стикозависимых изменений, при этом «незрелость» соедини- тельнотканных структур оказывает модифицирующее влияние не только на течение многих соматических заболеваний, но и выступает в качестве патогенетического фактора развития послеоперационных (ранних, поздних) осложнений [31]. Клеточный потенциал соединительнотканных структур десны у лиц молодого возраста с интактным пародонтом подтверждает наличие в ней клеток, обладающих высоким пролиферативным и дифференцировочным потенциалом, а также способностью к репаративной регенерации. Это позволяет рассматривать десну в качестве перспективного тканевого источника клеточного материала (стволовые клетки / клеточная терапия) для исполь- зования в регенеративной медицине [32, 33]. Заключение У пациентов со здоровым пародонтом и сопутствующей НДСТ, в сравнении с лицами без фоновой соединительнотканной патологии, установлена разнонаправленная динамика количе- ственных изменений в структурах десны (по Ме) – сокращение количества фибробластов (в 1,19 раза, р≤0,05), лимфатиче- ских сосудов с положительным окрашиванием на VEGFR-3 (в 1,16 раза, р≤0,05), доли Ki-67 позитивных эпителиоцитов (в 1,11 раза, р≥0,05), доли Ki-67 позитивных фибробла- стов (в 1,36 раза, р≤0,05) при увеличении числа лаброцитов (в 1,65 раза, р≤0,05), доли р-53 позитивных эпителиоцитов (в 1,45 раза, р≤0,05), доли р-53 позитивных фибробластов (в 1,68 раза, р≤0,05). Статистически достоверные различия (р≤0,05) между количеством CD68 позитивных макрофагов в исследуемых группах не выявлены. Достоверное (р≤0,05) сокращение пролиферативной активно- сти фибробластов, количества лимфатических сосудов с пози- тивным окрашиванием на VEGFR-3, интенсивности экспрессии белка клеточной адгезии Е-кадгерина в сочетании с приростом экспрессии белка p53 и числа адипоцитов является ключевыми звеньями механизма сокращения общего количества фибробла- стов в эпителии и собственной пластинки десны, что определяет снижение регенераторного потенциала у лиц с НДСТ.