Цитологическая диагностика ВПЧ-ассоциированного плоскоклеточного рака орофарингеальной зоны

Введение. Определение ВПЧ (вирус папилломы человека)-статуса плоскоклеточной карциномы орофарин- геальной зоны крайне важно еще до начала лечения, поскольку ВПЧ(+) и (-) опухоли имеют разный прогноз и чувствительность к лечению.
Цель исследования. Оценить возможность использования цитологического метода в диагностике ВПЧ- ассоциированной орофарингеальной плоскоклеточной карциномы (ОФПКК). 

Материал и методы. В работе представлены результаты цитологического определения ВПЧ-инфекции в 58 образцах опухолей от пациентов с установленным диагнозом «плоскоклеточная карцинома орофарин- геальной области», проходивших лечение в стационаре МНИОИ им. П.А. Герцена в период с 2016 по 2020 г. 

Для определения ВПЧ-инфекции применяли традиционную, жидкостную цитологию, полимеразную цепную реакцию (ПЦР), иммуноцитохимию.
Результаты. В результате проведения ПЦР-исследования ВПЧ был обнаружен у 6 (10%) из 58 пациентов с ОФПКК. У 5 пациентов был обнаружен 16 тип ВПЧ, у 1 пациента – 18 тип ВПЧ. Иммуноцитохимически экспрессия р16 была выявлена у 18 (31%) пациентов. 

Заключение. Иммуноцитохимическое определение экспрессии р16 может быть рекомендовано для диагно- стики ВПЧ-ассоциированной ОФПКК, особенно в случаях метастатического поражения лимфатических узлов. Ключевые слова: плоскоклеточный рак, вирус папилломы человека, лимфатические узлы, метастазы без первичного очага, ВПЧ-ассоциированный рак, полимеразная цепная реакция, жидкостная цитология, орофарингеальная карцинома 

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Финансирование. Работа выполнена без спонсорской поддержки.

Введение

Распространенность злокачественных новообразований (ЗНО) головы и шеи занимает 6-ю позицию в мире, составляя более 700 тыс. новых случаев в год [1]. Наиболее часто опухоли головы и шеи локализуются в орофарингеальной области (ОФО). В последние годы в России, как и в мире, наблюдается увеличение числа случаев рака ОФО, при этом отмечается тенденция к снижению среднего возраста начала заболевания орофарин- геальной плоскоклеточной карциномой (ОФПКК), что является результатом роста числа инфицированных онкогенными типами вируса папилломы человека (ВПЧ) [2, 3]. В 70-х гг. ХХ века была доказана роль ВПЧ в развитии плоскоклеточного рака шейки матки. За это открытие в 2008 г. немецкий медик и ученый Харальд цур Хаузен был награжден Нобелевской премией. Основным этиологическим фактором развития опухолей ОФО долгое время считалось употребление алкоголя и табака, тем не менее, не все случаи ОФПКК можно связать с этими вредными привычками [4]. В 1983 г. была показана взаимосвязь ВПЧ с ОФПКК [5]. В настоящее время идентифицировано 220 типов ВПЧ, 15 из них рассматриваются как факторы риска развития ОФПКК [6].  ВПЧ относится к ДНК вирусам без оболочки, способным инфицировать кожные покровы и слизистые оболочки [7]. Различные типы ВПЧ можно разделить на две группы низкого и высокого канцерогенного риска, в зависимости от способности вируса запускать механизм злокачественной транс- формации клеток. К подтипам высокого риска относятся ВПЧ 16, 18, 31, 33, 35, 45, 51, 52 и 56 типов, наиболее часто эти- ологическим фактором ОФПКК является ВПЧ 16 типа [8, 9]. На данный момент ВПЧ рассматривается как один из факторов развития ОФПКК. По данным различных авторов, примерно 25% случаев рака головы и шеи ассоциированы с ВПЧ, а в группе ОФПКК этот показатель может доходить до 60% [3, 6, 10]. Доказано, что ВПЧ-позитивные ОФПКК представляют собой отдельную нозологическую форму с различными эпидемиологическими, биологическими и клиническими исходами (табл. 1) [11, 12].

Группа ВПЧ-позитивных пациентов отличается от ВПЧ- отрицательных больных ОФПКК. Как правило, пациенты, инфи- цированные ВПЧ, это молодые люди, не имеющие большого стажа курения и употребления алкоголя [5, 6, 13]. Наиболее часто ОФПКК, ассоциированная с ВПЧ-инфекцией, представлена плоскоклеточной неороговевающей карциномой [14]. В свою очередь отличается и прогноз в группе ВПЧ-позитивных пациентов, данные опухоли склонны к раннему региональному метастазированию, имеют небольшой размер и хорошую чувствительность к лекарственной и лучевой терапии [1, 15].

ВПЧ-позитивные опухоли, по данным литературы, обычно имеют строение неороговевающего плоскоклеточного рака. При гистологическом исследовании опухоль представлена пластами клеток овальной или веретеновидной формы, имеющих гиперхромные ядра и нечеткие контуры цитоплазмы [16]. Однако одного лишь гистологического метода недостаточно для определения ВПЧ-статуса опухоли, поскольку другие варианты плоскоклеточного рака также могут быть ассоциированы с ВПЧ инфекцией [3]. По современным клиническим рекомендациям, наиболее эффективными методом определения ВПЧ- статуса является иммуногистохимическое (ИГХ) определение белка p16INK4a. Таким образом, по данным литературы, р16 является наиболее эффективным маркером для определения ВПЧ-ассоциированной ОФПКК [17].

В настоящее время в мире не существует общего мнения относительно методов диагностики и контроля лечения опухолей ОФО. Ряд авторов ведут работы по разработке оптимального подхода к решению данной проблемы [9]. Одним из перспективных методов ранней диагностики ОФПКК является определения ВПЧ в ротовой полости с использованием метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) [10, 18]. Современным биомаркером оценки рецидива ОФПКК может стать определение плазма циркулирующих опухолевых ВПЧ ДНК (ctHPVDNA). По данным ряда авторов, двукратное последовательное определение ctHPVDNA в плазме крови после лечения имеет высокую чувствительность выявления рецидива ВПЧ-ассоциированной ОФПКК и может способствовать раннему началу терапии [19].

Учитывая выделение двух вариантов ОФПКК – ВПЧ+ и ВПЧ- (в соответствии с классификацией ВОЗ, 2017), обладающих разным прогнозом и ответом на лечение, их четкое разделение необходимо еще до начала лечения (табл. 1) [20].

По данным литературы, примерно у 50% пациентов с ОФПКК изначально наблюдают метастазы в лимфатические узлы (л/у) [21]. У таких пациентов тонкоигольная аспирационная биопсия (ТИАБ) является оптимальным методом получения диагностического материала. Следует иметь в виду, что это может быть единственным морфологическим материалом, если пациент прошел предоперационную лучевую терапию и первичная опухоль уже не определяется. При этом обнаружение ВПЧ в цитологических препаратах представляет определенную трудность. В данный момент не существует клинических рекомендаций по определению экспрессии р16 в цитологических препаратах, хотя эта методика достаточно долгое время используется для исследования материала из шейки матки. В литературе описывается ИЦХ-исследование экспрессии р16 только на материале ТИАБ лимфоузлов, и число сообщений ограничено [22]. Цитологический метод (ЦМ) недостаточно используется для диагностики первичных опухолей ОФО, чаще его применяют для определения метастазов. Тем не менее внедрение жидкостной цитологии (ЖЦ), ИЦХ, молекулярно-генетических методов исследования с использованием цитологического материала позволяет использовать ЦМ для установления полноценного морфологического диагноза и определения ВПЧ-ассоциированных ОФПКК.

Цель исследования – оценить возможность использования ЦМ в диагностике ВПЧ-ассоциированной ОФПКК.

Материал и методы

В работе представлены результаты цитологического определения ВПЧ-инфекции в 58 образцах опухолей от пациентов с установленным диагнозом плоскоклеточный рак ОФО, проходивших лечение в стационаре МНИОИ им. П.А. Герцена по поводу ОФПКК в период с 2016 по 2020 г. Средний возраст пациентов на момент лечения составил 58±5 лет. В гендерном отношении преобладали мужчины, их число составило 34 (59%), число женщины – 24 (41%). У большей части пациентов (у 50 из 58) с плоскоклеточной карциномой ОФО (миндалина – 54 пациента, задняя треть языка – 2 пациента, задняя стенка ротоглотки – 2 пациента) имелись метастазы в л/у шеи. Клеточный материал для ЦМ и ИЦХ исследований был получен путем ТИАБ мета- статических л/у. У 8 пациентов метастазы в л/у не обнаружены и клеточный материал для цитологического исследования был получен из первичной опухоли. У 6 пациентов опухоль распола- галась в задней трети языка, у 2 – на задней стенке ротоглотки.

В исследовании применяли: традиционную цитологию, методы ЖЦ и ИЦХ.

Традиционный ЦМ – мазки-отпечатки с опухоли, материал ТИАБ наносили на предметное стекло, высушивали на воздухе, окрашивали азур-эозином в модификации Паппенгейма.

ЖЦ – клеточный материал (мазки, кусочки опухолевой ткани, материал ТИАБ) помещали в среду накопления, состоящую из растворов Хенкса, реополиглюкина и альбумина, смешанных в равных количествах. Из хорошо перемешанной клеточной суспензии в объеме 300 мкл готовили жидкостные препараты с использованием цитоцентрифуги (Cytospin Thermo Fisher Scintific). Готовые цитологические препараты высушивали на воздухе в течение 30 минут, окрашивали азур-эозином в модификации Паппенгейма.

ИЦХ проводили с антителами CK5/6, р63 для подтверждения наличия плоскоклеточного рака. Для выявления интегриро- ванной формы ВПЧ-инфекции готовые жидкостные препараты окрашивали с использованием моноклонального антитела p16 (клон R19-D; DB Biotech, Словакия, в разведении 1:100), который является суррогатным маркером транскрипционно активного ВПЧ высокого риска. Оценка ИЦХ-теста на белок р16 проводилась с учетом интенсивного окрашивания ядер и цитоплазмы более 75% опухолевых клеток, что оценивали как положительное окрашивание.

ПЦР-определение ВПЧ в клеточной суспензии проводилось методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени с использованием набора АмплиСенс® ВПЧ ВКР генотип-FL. Амплификация и детекция проводились на приборе Rotor-Gene 3000 (Corbett Research, Австралия).

Результаты

В результате проведения ПЦР-исследования ВПЧ был обнаружен у 6 (10%) из 58 пациентов с ОФПКК. У 5 пациентов был обнаружен 16 тип ВПЧ, у 1 пациента – 18 тип ВПЧ (табл. 2).

Методом ИЦХ была определена гиперэкспрессия белка p16, являющегося биомаркером интегрированных форм ВПЧ при плоскоклеточном раке. Экспрессия р16 была выявлена у 18 (31%) пациентов. Были проведены цитогистологические сопоставления, данные ИГХ и ИЦХ совпали во всех случаях.

Клинический пример

Пациент С. 57 лет обратился в поликлиническое отделение МНИОИ им. П.А. Герцена 01.02.2021 по поводу опухолево- го образования подчелюстной области. При ультразвуковом исследовании установлен клинический диагноз: «метастати- ческое поражение подчелюстного л/у без первично-выявленного очага». Проведена ТИАБ л/у с забором цитологического материала для традиционной и ЖЦ. По данным цитологи- ческого исследования: метастаз неороговевающего плоскоклеточного рака (рис. 1). Проведено ИЦХ-исследование с использованием следующей панели антител: общие цито- кератины, CK 5/6, р63, р16, EBV (рис. 2). В результате опу- холевые клетки экспрессировали общие цитокератины, CK 5/6, р63, р16, что соответствовало плоскоклеточному нео- роговевающему раку, ассоциированному с ВПЧ, и позволило предположить наличие первичного опухолевого очага в ротоглотке.

При дальнейшем обследовании была проведена эксцизионная биопсия подчелюстного л/у справа и биопсия минда- лины справа. По результатам гистологического исследования в миндалине определялся плоскоклеточный неороговевающий рак, а также метастатическое поражение л/у неороговевающим плоскоклеточным раком кистозно-солидного строения (рис. 3). При ИГХ-исследовании определялась положительная экспрессия общих цитокератинов, СК5/6, р63, р16. Таким образом, данные цитологического и ИЦХ исследований совпадали с данными гистологического и ИГХ-исследований. На основе данных исследований был диагностирован плоскоклеточный неорговевающий ВПЧ-позитивный рак миндалины с метастазом в подчелюстной л/у.Цитологическое и ИЦХ исследования позволили в кратчайшие сроки определить первичный опухолевый очаг.

Проведение ПЦР и ИЦХ исследований в одной группе больных показало более высокую чувствительность ИЦХ-исследования в отношении определения ВПЧ-ассоциированного ОФПКК по сравнению с результатами ПЦР-исследований. Это может объясняться наличием интегрированных форм ВПЧ, которые не всегда выявляются методом ПЦР.

Внедрение ЖЦ позволило одновременно использовать клеточный материал для молекулярно-генетического (ПЦР), традиционного цитологического и ИЦХ исследований. Проведенные цито-гистологические сопоставления показали высокую чувствительность ИЦХ-исследования, что позволяет использовать цитологический материал для определения ВПЧ-ассоциированного ОФПКК, а также в случаях метастазов плоскоклеточного рака без первично выявленного очага.

Заключение

Использование ИЦХ-исследований в определении ВПЧ- ассоциированной ОФПКК имеет высокую достоверность, сравнимую с ИГХ-исследованием, и превышает ПЦР-исследования.

ИЦХ-исследование экспрессии р16 может быть рекомендовано для диагностики ВПЧ-ассоциированного ОФПКК, особенно в случаях метастатического поражения л/у.