Применение липосомально-антиоксидантного комплекса в профилактике и лечении синдрома реперфузии. Экспериментальное исследование

На фоне совершенствования методов восстановления кровообращения при острых ишемических поражениях различных локализаций и применения антикоагулянтной и антиагрегантной терапии для поддержания проходимости реканализованной артерии до настоящего времени не имеется эффективной терапии для профилактики реперфузионного повреждения тканей, что и определило цель и задачи настоящего исследования.

Цель исследования. В статье представлены собственные данные по изучению влияния липосомально-антиоксидантный комплекса «Фламена», вводимого внутривенно, на степень повреждения миокарда у крыс в модели ишемии-реперфузии.

Материал и методы .
Исследование было выполнено на 53 половозрелых самцах белых беспородных крыс.

Результаты. Показана эффективность применения препарата, проявившаяся снижением размеров необратимо поврежденных тканей, снижением процента крупных инфарктов. Установлено, что оптимальнойдозой препарата при экспериментальном инфаркте миокарда является 2,9 мл/кг.

Заключение. Эффективность липосомально-антиоксидантного комплекс «Фламена», особенно показанная на травматичной экспериментальной модели ИР у малых лабораторных животных и при длительной ишемии, говорит о перспективности такого способа профилактики реперфузионного повреждения при острых ишемических событиях и диктует необходимость дальнейших исследований.

Ключевые слова: липосомально-антиоксидантный комплекса «Фламена», профилактика и лечение синдрома реперфузии, миокард

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Финансирование. Работа выполнена без спонсорской поддержки.  

Despite the improvement of blood circulation restoration methods in acute ischemia of various localizations and the use of anticoagulant and antiplatelet therapy to maintain the reperfused artery patency, there is still no effective
prevention of reperfusion tissue injury, which determined the aim and objectives of the present study.
Objective of the study. The article presents our own data on the effect of intravenously injected liposomal antioxidant complex «Flamena» on the degree of myocardial damage in rats in the ischemia-reperfusion model.
Material and Methods. The study was performed on 53 mature male white outbred rats.
Results. The efficacy of the agent has been shown, expressed by a decrease in the size of irreversibly damaged
tissues, a decrease in the percentage of large infarctions. The optimal dose of the substance in experimental myocardial infarction was found to be 2.9 ml/kg.
Conclusion. The efficacy of liposomal-antioxidant complex «Flamena», especially demonstrated on the traumatic experimental IR model in small laboratory animals with prolonged ischemia, suggests the potential of this method
of reperfusion injury prevention in acute ischemic events and dictates the need for further research.
Keywords: liposomal-antioxidant complex «Flamena», prevention and treatment of reperfusion syndrome, myocardium
Conflicts of interest. The authors have no conflicts of interest to declare.
Funding. There was no funding for this study
For citation: Matveev D.V., Gavrilova S.A., Kuznetsov M.R., Akhmetshina M.R., Ivanov E.V., Evteev A.V.,
Kuznetsova M.M., Nochnoy M.S. Liposomal-antioxidant complex in the prevention and treatment of reperfusion syndrome. Experimental study. Head and neck. Russian Journal. 2022;10(4):16–23

Введение
Реперфузионный синдром – это комплекс клинических проявлений восстановления кровообращения в ранее ишемизированных тканях, сопровождающийся повреждением клеток,тканей и органов на местном и системном уровнях с развитиемполиорганной недостаточности [1–2].
В частности, ишемическая болезнь сердца обычно связана с пагубными последствиями острого ишемического и реперфузионного повреждения миокарда. Ишемически-реперфузионноепоражение возникает у пациентов с острым инфарктом миокарда с подъемом сегмента ST, в случае которого наиболееэффективным методом лечения является своевременная и эффективная реваскуляризация миокарда с использованием тромболитической терапии или первичных чрескожных коронарных вмешательств. Однако процесс реперфузии миокарда может сам по себе вызвать дальнейшую гибель обратимо поврежденных кардиомиоцитов – явления, известного как реперфузионное повреждение миокарда [3–5].

Существует огромное число факторов развития патологических изменений в зависимости от органа-мишени, однако окислительный стресс является наиболее важным и общим путем развития реперфузионного синдрома, вне зависимостиот основной патологии (ишемическая болезнь сердца, хроническая ишемия нижних конечностей, острое нарушение мозгового кровообращения). Окислительный стресс – это нарушение баланса про- и антиоксидантов в пользу первых, приводящее к разрушению биологически важных молекул [6].

Проблема лечения реперфузионного синдрома до сих поростается актуальной. Среди применяемых методов – фармакотерапия, ишемическое пре- и посткондиционирование, гипербарическая оксигенация и др. [7–10]. Однако главным компонентомлечения и профилактики реперфузионного повреждения должнабыть антиоксидантная терапия.
Липосомально-антиоксидантный комплекс, используемый в данном исследовании, разработан научной компанией«Фламена», представляет собой эмульсию в виде липосом из фосфолипидов животного происхождения с включением в них известного и высокоэффективного антиоксиданта природного происхождения – дигидрокверцетина (0,4%). Этот липосомальный антиоксидантно-фосфолипидный комплекс был полученпо запатентованному методу (патент РФ №2369383 [11], патентШвейцарии №702736). Благодаря липосомам комплекс обладает уникальными возможностями направленного воздействия на клетку, обусловленного структурной схожестью липосом с мембранами клеток по химическому составу. Уникальной особенностью липосом является возможность транспорта лекарственных средств внутрь клеток, с которыми они взаимодействуют путем слияния или эндоцитоза.

Лецитин, входящий в состав комплекса, как основной структурный компонент липосом, обладаетполным сродством с липидами клеточных мембран человека,что позволяет организовать адресную доставку действующих
веществ и повысить эффективность лекарственных средств.Соответственно, снижается риск возникновения нежелательныхиммунных реакций и общее токсическое воздействие активного вещества.

Комплекс «Фламена» успешно применяется в составе раневого покрытия при длительно незаживающих ранах [12, 13],гинекологической патологии [14, 15], в качестве лекарственногосредства при острой и хронической интоксикации [16, 17]. Цель работы – определение эффективности применения липосомально-антиоксидантного комплекса «Фламена» в профилактике и лечении синдрома реперфузии у лабораторныхживотных (крыс).

Материал и методы
Работа была проведена на 53 половозрелых самцах белых беспородных крыс массой 368 (335; 393) г с соблюдениемтребований приказа Минздрава РФ от 1 апреля 2016 г. №199н «Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики».
Рандомизация животных была произведена по массе.Моделирование инфаркта миокарда Крыс наркотизировали внутрибрюшинной инъекцией хлоралгидрата в дозе 400 мг/кг. Инфаркт миокарда моделировали обратимой 2,5-часовой перевязкой левой коронарной артерии (ЛКА) без вскрытия грудной клетки, без использования аппарата искусственной вентиляции легких. Операционное поле на груди животного освобождали от шерсти, обрабатывали спиртоми делали надрез. Затем аккуратно отсепаровывали от ребермышцы, находящиеся слева от грудной клетки, не допуская их разрыва или повреждения. В межреберье в области верхушечного толчка делали прокол, через который выталкивали сердце. Накладывали лигатуру на ЛКА, расположенную в области на границе правого желудочка миокарда и ушка предсердия; отступали примерно на 4 мм от фиброзного кольца.
Эвтаназия животных и отбор материала для гистологического исследования
Эвтаназию животных осуществляли глубокой наркотизацией животных хлоралгидратом (не менее 400 мг/кг). Сердце иссекали из грудной полости, промывали водой и замораживалипри температуре -20 oС.

Оценка размера поражения миокарда
Размер некроза оценивали через 72 часа после ишемии-реперфузии (ИР) планиметрически в срезах сердца толщиной 1,5 мм, окрашенных 1% раствором 2,3,5-трифенилтетразолия хлорида. После остановки реакции 10% формалином срезы помещали между предметными стеклами и сканировали с обеихсторон. В программе AUC рассчитывали процент площади пораженной ткани к общему размеру среза сердца.

Введение комплекса «Фламена»
Исследуемое вещество – комплекс «Фламена», вводили внутривенной инфузией в бедренную вену в дозах 2,9 или 1,45мл/кг в течение 10 минут, начиная за 5 минут до реперфузии.Физиологический раствор вводили эквивалентно. В эксперименте соблюдали стерильность. Общая схема экспериментапоказана на рис. 1.

Экспериментальные группы животных
В исследовании было сформировано 4 экспериментальные
группы животных:
1. ИР с внутривенным введением комплекса «Фламена» в дозе 2,9 мл/кг (F-1, N=8);
2. ИР с внутривенным введением комплекса «Фламена» в дозе 1,45 мл/кг (F-2, N=5);
3. ИР с внутривенным введением физиологического раствора в дозе 2,9 мл/кг (C-1, N=21);
4. ИР с внутривенным введением физиологического раствора в дозе 1,45 мл/кг (C-2, N=19).

Также исследовали эффекты комплекса «Фламена» относительно объединенной контрольной группы c внутривенным введением физиологического раствора в дозировках 2,9 и 1,45 мл/кг (С, N=13). Данное объединение оправдано, поскольку введенное крысам в кровоток дополнительное количество физиологического раствора довольно быстро выводится из кровотока почками. В отчете представлены результаты обработки данных как относительно раздельных контрольных групп (С-1 и С-2), так и для объединенной группы (С).

Статистическая обработка результатов
Результаты представлены в виде медианы и 1 и 3 квартилей. Статистическая обработка результатов проведена в программе Statistica 6.0. Значимость различий между независимыми группами оценивали непараметрическим U-тестом Манна–Уитни.Смертность и частоту возникновения крупных инфарктов оценивали χ2-критерием. Критический уровень значимости принимали равным 0,05.

Результаты
Оценка массы тела животных Важным показателем здоровья и самочувствия животных является их масса. Масса телакрыс до операции в контрольных группах составляла 362 (354; 374) г – в группе C-1 и 369 (359; 370) г – в группе С-2, а у крыс с введением комплекса «Фламена» – 376 (357; 394) г – в группе F-1 и 371 (350; 403) г – в группе F-2. Через 72 часа после ИР наблюдали статистически не значимое снижение массы тела крыс по отношению к
дооперационному значению в связи с ухудшением самочувствия Рис. 3. Масса тела крыс во время проведения эксперимента * – p<0,05 для группы F2: сравнение величины. Figure 3. Body weight of the rats during the experiment * – p<0.05 for group F2: value comparison. животных до величин: 348 (340; 370) г – в группе C-1; 361 (340; 364) г – в группе C-2 и 373 (333; 391) г в группе F-1. В группе F-2 через 72 часа после ИР было показано статистически значимое снижение массы тела на 10% от дооперационного уровня до величины 338 (313; 353) г (рис. 2). При этом при межгрупповом сравнении массы тела крыс до и после операции статистически значимых отличий выявлено не было. Таким образом, комплекс «Фламена» не оказывает общего оздоровительного эффекта и не ухудшает общего состояния крыс. При объединении контрольных групп были получены анало- гичные результаты. Масса тела крыс в контрольной группе С до и после операции составляла 366 (353; 371) и 355 (335; 368) г соответственно (рис. 3). Отличий в изменении массы тела между объединенной контрольной группой и крысами, которым была введена «Фламена» обнаружено не было. Смертность крыс после моделирования ИР Всего было прооперировано 60 крыс. Животные, погибшие в результате введения наркоза (до окклюзии ЛКА, n=4) и окраши- вание сердец которых было избыточным (n=3), были исключены из эксперимента: всего 7 крыс. Результаты представлены в табл. 1 (раздельные контроли) и 2 (объединенные контроли). Внутривенная инфузия комплекса «Фламена» не повлияла на показатель смертности крыс. Влияние комплекса «Фламена» на размер поражения мио- карда через 72 часа после ИР Через 72 часа после ИР размер поражения миокарда в группе C-0,5 с введением физиологического раствора составлял 17,0 (13,1; 22,7)%; в группах с введением комплекса «Фламена» (рис. 4, 5): • F-0,1 – 13,2 (10,4; 18,2)%; • F-0,25 – 17,7 (12,5; 19,7)%; • F-0,5 – 9,2 (5,4; 12,8)%; • F-1 – 6,0 (3,9; 12,3)%. Комплекс «Фламена», введенный в больших объемах 1,45 мл/ кг (F-0,5) и 2,9 мл/кг (F-1) в 1,9 и 2,8 раза соответственно снижал размер поражения миокарда по сравнению с контрольной груп- пой С-0,5. Меньшие объемы исследуемого комплекса не влияли на размер некроза. Таким образом, была показана минимальная эффективная доза препарата (в рамках исследуемого ряда доз). Далее исследовали влияние комплекса «Фламена» на фор- мирование крупного (>9%) и малого (<9%) инфарктов. Малый инфаркт был зарегистрирован только в группах с введением «Фламены» и составлял: • F-0,1 – 7,5%; • F-0,25 – 5,9%; • F-0,5 – 4,4 (2,2; 7,7)%; • F-1 – 4,1 (2,4; 4,9)%. Участки поражения крупного размера наблюдали во всех исследуемых группах: в контрольной, С-0,5 – 17,0 (13,1; 22,7) % и в группах с введением комплекса «Фламена»: • 14,0 (12,4; 19,7) % – в группе F-0,1; • 18,2 (14,6; 20,1) % – в группе F-0,25• 13,8 (10,9; 16,7) % – в группе F-0,5; • 13,8 (11,8; 15,1) % – в группе F-1. С учетом размера выборки провели межгрупповое сравнение размера крупного инфаркта. Статистически значимых отличий при таком сравнении обнаружено не было. При проведении частотного анализа случаев возникновения малого и крупного инфарктов было показано, что c увеличением объема вводимого комплекса «Фламена» возрастала и доля инфарктов малого размера в общем количестве инфарктов. Так, было показано, что в группе F-0,1 процент малых инфарктов составлял 17%, в группе F-0,25 – 14%, в группе F-0,5 – 50% и в группе F-1 – 58% (рис. 6). Поскольку при анализе общего размера поражения было показано, что у крыс с введением комплекса «Фламена» в дозах 1,45 мл/кг (F-1) и 2,9 мл/кг (F-1) размер поражения был мень- шим, то можно сделать вывод, что данный эффект реализу- ется за счет снижения комплексом «Фламена» числа случаев возникновения крупного инфаркта, тем более, что смертность имела тенденцию к снижению. Результаты согласуются с полученными ранее данными о сни- жении размера поражения миокарда при инфузии «Фламены» в количестве 2,9 мл/кг. В проведенном ранее исследовании также было показано, что дальнейшее увеличение объема введения до величины 5,7 мл/кг нивелировало данный эффект. Вероятно, исследованная доза комплекса 2,9 мл/кг является оптимальной величиной, при введении которой реализуется кардиопротектор- ный эффект. С учетом полученных ранее данных был построен график доза-эффект (рис. 7). Обсуждение Установлено, что применение липосомально-антиоксидант- ного комплекса «Фламена» значительно (на 60%) уменьшает размеры некроза миокарда по сравнению с контрольной груп- пой. Это самый высокий показатель среди опубликованных для различных способов лечения в доступной нам литературе. Введение комплекса достоверно снижает число крупных инфар- ктов среди животных. Такой результат может быть обусловлен высокой эффективностью липосомального способа доставки антиоксидантного агента в клетку, обратимо поврежденную ишемией и, как следствие, адекватной защитой такой клетки от оксидативного стресса при реперфузии. Применение липосо- мально-антиоксидантного комплекса патогенетически оправдано непосредственно до и сразу после реперфузии. Установлено, что оптимальной дозировкой препарата у малых лабораторных животных является 2,9 мл/кг. Комплекс в такой дозе обеспечивает максимальный терапевтический эффект и при этом не влияет на общее состояние крыс, повышение же дозировки приводит к нивелированию терапевтического и проявлению токсического эффекта препарата. Заключение Эффективность липосомально-антиоксидантного комплекс «Фламена», особенно показанная на травматичной экспери- ментальной модели ИР у малых лабораторных животных и при длительной ишемии, говорит о перспективности такого спосо- ба профилактики реперфузионного повреждения при острых ишемических событиях и диктует необходимость дальнейших исследований.