Подбор оптимальных условий для изучения влияний обогащенной тромбоцитами плазмы in vitro на культуру дермальных фибробластов

Цель исследования: изучить действие обогащенной тромбоцитами плазмы (PRP) in vitro на культуру кле- ток дермальных фибробластов в зависимости от ее концентрации в среде, способа активации, плотности посадки клеток. Материал и методы. Для приготовления PRP использовали один из классических протоколов одноэ- тапного центрифугирования цельной крови здоровых доноров (n=4). Исследование проводили при разной плотности клеток (клеточная линия hTERT-HDFa – d220): 2500 кл./лунка, 5000 кл./лунка и 10 000 кл./лунка – 96-луночный планшет). В опытные лунки вносили активированную PRP доноров в концентрациях 10,0%, 5,0, 2,5%. В качестве контрольной активации использовали цикл «замораживание-размораживание», с серией экспериментов с дополнительной активацией 10% CaCl2 (20 𝜇𝜇л/мл). Анализ выживаемости и метаболической активности клеток проводили с помощью МТТ-теста. Миграционную активность фибробластов исследовали в ране in vitro (scratch assay). Морфологическую оценку клеток и определение механизмов клеточной гибели проводили при помощи флуоресцентной микроскопии с предварительной окраской образцов. Статистиче- ский анализ (StatTech v. 4.1.7). Результаты. Оценка жизнеспособности клеток линии hTERT-HDFa в зависимости от плотности посадки клеток продемонстрировала, что максимальная метаболическая активность фибробластов кожи челове- ка отмечается при первоначальной плотности посадки 2,5–5,0 тыс. клеток на лунку (25–50 тыс./мл), при увеличении плотности отмечается снижение интенсивности роста культуры. Оптимальные показатели жизнеспособности клеток регистрируются через 72 часа наблюдения. Влияние дополнительной к «замо- раживанию-размораживанию» активации CaCl2 PRP перед внесением в среду на жизнеспособность фи- бробластов оказалось несущественным. Результаты изучения раны in vitro показали, что область дефекта закрывается быстрее при использовании PRP в концентрациях 5–10%. Заключение. На основании оценки результатов воздействия PRP на культуру фибробластов кожи чело- века рекомендуется использовать 5–10% концентрацию активированного образца в культуральной среде, оптимальная посадочная плотность для данной культуры 25–50 тыс. кл./мл. Ключевые слова: тромбоциты, PRP-терапия, дермальные фибробласты человека, регенерация Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Финансирование. Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 24-25-00278, https://rscf.ru/project/24-25-00278/

Objective. To study the effects of platelet-rich plasma (PRP) in vitro on the culture of dermal fibroblasts depending on the plasma concentration in the medium, method of activation, and cell density. Material and methods. To prepare PRP, we used one of the classic protocols for one-step centrifugation of blood from healthy donors (n=4). The study included series with different cell densities (hTERT-HDFa – d220 cell line): 2500/well, 5000/well and 10000/well – 96-well plate). Activated donor PRP was added to the experimental wells at the concentrations of 10.0%, 5.0%, 2.5%. We used freeze-thaw cycle as a control activator, with a series of experiments with additional activation using 10% CaCl2 (20 𝜇𝜇l/ml). We analyzed cell survival and metabolic activity with the MTT test. The evaluation of fibroblast migration activity was done in a scratch assay. The assessment of cell morphology and the determination of cell death mechanisms were conducted using fluorescent microscopy with preliminary staining of samples. StatTech v. 4.1.7 was used for statistical analysis. Results. The viability assessment of the hTERT-HDFa cells with different cell densities demonstrated the maximum metabolic activity of human skin fibroblasts at an initial planting density of 2500–5000 thousand cells per well (25 000–50 000/ml), and a decrease in cell growth intensity with increasing density. The optimal cell viability values were reached after 72 hours of observation. The effect of PRP activation with CaCl2 supplementing the freeze-thaw cycle before addition to the medium on fibroblast viability was negligible. In the scratch assay, the defect area closed faster with PRP used at the concentrations of 5–10%. Conclusion. To assess the biological effects of PRP on human skin fibroblast culture, we recommend to use a 5–10% concentration of the activated sample in the culture medium; the optimal planting density for this cell culture is 25 000–50 000 cells/ml. Key words: platelets, PRP therapy, human dermal fibroblasts, regeneration Conflicts of interest. The authors have no conflicts of interest to declare. Financing. The study was supported by the Russian Science Foundation grant No. 24-25-00278, https://rscf.ru/ project/24-25-00278/

Введение. Репаративная регенерация – важнейший биологический про- цесс, необходимый для восстановления структуры и функции тканей после повреждения. Нарушение процесса заживления сопровождается формированием рубцов, хронических ран, нарушением функции ткани и органа. Особую актуальность данная проблемы приобретает в аспекте восстановления тканей после хирургического лечения и лучевой терапии патологии ЛОР-органов и лицевой области, где имеет значение отсутствие не только функциональных, но и косметических дефектов [1–3]. Распространенной проблемой является восстановление тканей после лучевого повреждения при радиотерапии онкологиче- ских болезней головы и шеи [4, 5]. В настоящее время активно разрабатываются новые и совершенствуются старые подходы к стимуляции репаративного потенциала тканей и ускорению процессов заживления [6, 7]. Важными участниками и модуляторами процесса заживле- ния являются тромбоциты. Одним из эффективных способов повышения эффективности процессов заживления является использование обогащенной тромбоцитами аутоплазмы (PRP). PRP содержит множество факторов роста и других биологи- чески активных белков, включая VEGF, PDGF, TGF, хемокины, фибронектин, витронектин, плазменные факторы свертывания. PRP действует как противовоспалительное и прорегенеративное средство, ускоряя процесс заживления ран [8]. Несмотря на положительные эффекты PRP-терапии, дан- ный метод регенеративной медицины имеет свои ограничения и проблемные аспекты. Традиционно PRP используют в свежем виде сразу после приготовления, при этом активно ведутся поиски способов хранения данного биологического препарата без утраты его кли- нической эффективности [9, 10]. В ряде исследований показано, что замораживание плазмы для сохранения и последующего использования может стать ключом к расширению показаний и увеличению ситуаций клинического применения PRP-терапии [11, 12]. В других исследованиях продемонстрировано, что хранение плазмы без использования отрицательных температур также позволяет сохранить ее прорегенераторную активность за счет сохранения концентраций биологически активных веществ и стимулирующего действия на культуру клеток [13]. Другим неоднозначным аспектом применения PRP-терапии является выбор метода активации тромбоцитов перед исполь- зованием препарата. Активация тромбоцитов является важ- ным процессом при использовании PRP, который, во-первых, способствует выбросу тромбоцитами α-гранул, содержащих бόльшую часть биологически активных веществ, регулирующих процесс регенерации тканей, во-вторых, способствует актива- ции фибриногена и инициации формирования фибриновой матрицы, также играющей важную роль в процессе заживления. Существует несколько подходов к активации PRP: использова- ние химических активаторов (CaCl2, тромбин, коллаген), при менение физического подхода – цикл замораживание/размора- живание, использование ультразвука, механическая активация с использованием фильтра с микропорами [14, 15]. Ряд исследователей для клинических исследований рекомен- дуют использовать неактивированную плазму [14]. Таким образом, в настоящее время существует широкий диапазон мнений, основанных на результатах исследований, посвященных изучению способов хранения и активации PRP, тем не менее подобные исследования остаются актуальными и необходимыми в аспекте создания универсального протокола подготовки PRP для клинического применения. Фибробласты играют ключевую роль в процессе заживления ран, синтезируя факторы роста, компоненты внеклеточного матрикса, регулируя процессы сокращения раны, ее реэпи- телизацию и ремоделирование [16]. Культура дермальных фибробластов достаточно часто используется для оценки вли- яний различных прорегенераторных препаратов, в т.ч. и PRP, объективно отражая особенности клеточного ответа на различ- ные стимулирующие влияния [17]. Но до настоящего времени открыты вопросы подбора оптимальных концентраций PRP в культуральной среде, плотности посадки клеток и использо- вания метода активации плазмы перед введением. Цель исследования. Данное исследование посвящено изуче- нию свойств PRP in vitro и ее влияний на культуру клеток дер- мальных фибробластов в зависимости от ее концентрации в среде, способа активации, плотности посадки клеток. Материал и методы Процедура PRP. Для приготовления PRP использовали цель- ную кровь 4 здоровых доноров (средний возраст±SD: 20,3±0,8). Исследуемые подтвердили, что не курят, не принимали каких- либо лекарственных препаратов в течение недели до исследо- вания. Отсутствие хронических соматических и острых инфек- ционных заболеваний подтверждено данными врачебного осмотра и медицинской документации исследуемых. Общий анализ крови выполняли на анализаторе Mindray BC-3600 (Китай). Содержание форменных элементов крови было в пределах референсных значений для данной возрастной груп- пы, число тромбоцитов цельной крови (M±SD) – 232,3±38,3/л. Кровь забирали в пробирки (Improve 4,5 мл, с цитратом натрия 1:9 3,8%) Для приготовления PRP использовали один из клас- сических протоколов одноэтапного центрифугирования [18] (ELMI Centrifuge CM-6MT, ротор 6М.02) 270 g 7 минут при температуре 22 °С; регистрировали фракционирование ком- понентов крови: эритроциты – нижний слой, лейкоцитарное кольцо – средний слой, плазма – верхний слой. Отбирали 1 мл плазмы (1/2 общего объема плазмы в среднем) из зоны непо- средственно над лейкоцитарным кольцом, число тромбоцитов в готовых образцах составило (M±SD): 613,2±125,2 /л. Плазму помещали в стерильные пробирки типа Eppendorf, замора- живали при температуре -20 °С, срок хранения до 1 месяца. Безопасность подобного способа хранения показана в ряде исследований [11]. +10% CaCl2 5% Культура клеток. Клеточная линия hTERT-HDFa (d220) (20 µл/мл иммортализованных дермальных фибробластов человека 10% 270 г была получена из УНУ «Коллекция клеточных культур» ИБР 7 минут -20 °C РАН. Исследование проводили при разной плотности клеток: 1 месяц Размораживание, 2500 кл./лунка, 5000 кл. /лунка и 10000 кл./лунка (96-луночный PRP 1 час инкубирова- ние, центрифугиро- 2,5% планшет); 25 000/ лунка для 24-луночного планшета. Для куль- вание 4000 г 7 минут тивирования использовали среду DMEM (Servicebio, Китай) с 5% добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) (Biosera, Франция) и 1% пенициллин-стрептомицин (Панэко, Россия). 10% Клетки инкубировали при 37 °С и 5% CO2 в течение 24 часов. Затем полная питательная среда заменялась на среду без сыво- ротки. В опытные лунки вносили активированную PRP доноров в концентрациях 10,0%, 5,0, 2,5%. Пробы без внесения PRP – отрицательный контроль. В качестве положительного контроля использовали аналогичную среду без PRP с добавлением 10% FBS (fetal bovine serum). Активация тромбоцитов. В качестве активации использовали цикл «замораживание-размораживание». По данным предвари- тельных серий экспериментов, данный способ активации является не вполне контролируемым и достаточным, на основании чего было принято решение сравнить эффективность данного вида активации с результатами проб с дополнительной активацией 10% CaCl2 (20 л/мл) с последующей инкубацией в течение 1 часа при температуре 22 °С [19] и центрифугированием (EBA 21 Hettich, 4000 g х10 минут) для отделения фибринового сгустка. После чего супернатант активированной PRP отбирали и вносили в культуру клеток в соответствующей концентрации (рис. 1). МТТ-тест. Анализ выживаемости клеток с помощью МТТ-теста проводился для определения наиболее эффективных условий эксперимента оценки влияний PRP на культуру фибробластов кожи человека (ФКЧ). Через 24, 48 и 72 часа инкубации кле- ток с PRP добавляли раствор МТТ (5 мг/мл) и инкубировали 3,5 часа в стандартных условиях. Образовавшиеся кристаллы формазана растворяли с помощью ДМСО (диметилсульфок- сид). Оптическую плотность образцов измеряли с помощью спектрофотометра (Thermo Scientific, США) при длине волны 570 нм против 650 нм. Жизнеспособность клеток в образце оце нивали относительно данных контроля (-), показатели которого 25000 клеток принимали за 100%. Протокол исследование раны in vitro (scratch assay). Клетки рассаживали в 24-луночный планшет (25 тыс. кл./лунка). Клетки инкубировали при 37 °С и 5% CO2 в течение 24 ччасов. В моно- слое клеток кончиком дозатора (200 мкл) создавали дефект, hTERT-HDFa после чего вносили PRP согласно схеме (рис. 1). Инкубировали 24 часа при тех же условиях. Морфологическую оценку клеток и фотографирование дефекта проводили через 0, 4 и 24 часа с помощью инвертированного микроскопа Микромед-И (Россия) и камеры Toupcam (Китай). Расчет % закрытия раны поводили в программе Fiji ImageJ (Research Services Branch of the National Institute of Mental Health USA) по формуле: закрытие раны= (S раны в 0 час.-S раны 24 час.)/S раны в 0 час.)*100%, где МТТ тест (24, 48, 72 часа) Рана in vitro S раны – площадь раны в мкм2 [20]. Флуоресцентная микроскопия. Морфологическую оценку, а также механизмы клеточной гибели проводили с помощью флуоресцетной микроскопии при двойном окрашивании акри- диновым оранжевым (АО) 100 мкг/мл и йодистым пропидием (PI) 100 мкг/мл через 48 часов инкубации согласно протоколу [21]. AO окрашивает ядра живых клеток в зеленый цвет, апо- тотических – в яко-зеленый и желтый. PI проникает только в клетки с нарушением целостности мембраны и окрашивает ядро красным. Флуоресцентную микроскопию проводили на люминесцентном инвертированном микроскопе BM35FXT (ICOE, Китай). Микрофотографии делали с помощью цифровой каме- ры Ломо МС-20 (Россия). Статистический анализ. Программы StatTech v. 4.1.7 (ООО «Статтех», Россия). Оценка соответствия нормальному распреде- лению — критерий Шапиро–Уилка. Сравнение групп с помощью критерия Краскела–Уоллиса, апостериорные сравнения – с по- мощью критерия Данна с поправкой Холма. Различия считались статистически значимыми при p<0,05. Формат описания данных медиана (Me), нижний и верхний квартили (Q1–Q3). Результаты Оценка жизнеспособности клеток линии hTERT-HDFa в зависи- мости от плотности посадки клеток продемонстрировало нали чие достоверных межгрупповых отличий (табл. 1). Причем опти- мальные показатели жизнеспособности клеток регистрировали через 72 часа наблюдения. Влияние дополнительной активации CaCl2 PRP перед внесением в среду на жизнеспособность ФКЧ оказалось несущественным, но при этом было более удобно в аспекте управления процессом активации и приготовления необходимых разведений PRP. Оценка влияния различных концентраций PRP в культу- ральной среде на жизнеспособность и метаболическую актив- ность ФКЧ выявила, что наименее эффективно внесение PRP в концентрации 2,5%. Использование PRP в концентрациях 5,0 и 10,0% показало сопоставимые результаты (рис. 2). Учитывая результаты МТТ-теста, для оценки влияние PRP на деление и миграцию клеток были выбраны концентрации плазмы 5% и 10% с применением обоих способов активации. Исследования показали, что миграция клеток происходила во всех группах (рис. 3), и дефекты закрылись на 2/3 в течение 24 часов, через 48 часов регистрировали полное закрытие раны. Обсуждение Результаты исследования показали, что жизнеспособность и метаболическая активность фибробластов зависит от плотности посадки культуры, концентрации PRP в среде, срока наблюдения после внесения плазмы. Оптимальная плотность посадки, при которой выявляется максимальная метаболическая активность ФКЧ является 2,5–5,0 тыс. клеток на лунку (25–50 тыс./мл), при увеличении плотности отмечается снижение интенсивности роста культуры. Проведенные исследования показали доста- точность цикла «замораживание-размораживание» как способа активации PRP, что согласуется с исследованиями других авто- ров. [21] Дополнительное внесение CaCl2 не оказывало суще- ственного влияния на показатели метаболической активности и подвижности ФКЧ. Но следует отметить, что дополнительное внесение CaCl2 ускоряло процесс образования фибринового сгустка, что в итоге снижало вязкость супернатанта и не затруд- няло процесс разведения PRP. Также в литературе показано, что внесение CaCl2 увеличивает дегрануляцию тромбоцитов и повышает содержание факторов роста по сравнению с актива- цией при размораживании [23]. Изучение метаболической активности культуры на разных сроках культивирования показало наилучшие результаты через 72 часа наблюдения. В первые сутки после внесения PRP реги- стрировали снижение метаболической активности ФКЧ, что, вероятно, связано с присутствующими в плазме продуктами деградации тромбоцитов и другими факторами, ингибирую- щими рост. Полученный результат не согласуется с данными литературы относительно данного срока наблюдения, хотя к 3-м суткам эксперимента мы регистрировали увеличение жизне- способности и метаболической активности аналогично данным исследованиям [17, 24]. Одним из важных свойств ФКЧ является их миграционный потенциал в ситуации повреждения, что является важным меха- низмом реализации процессов заживления ран. Результаты изучения раны in vitro показали, что область царапины закрыва- ется быстрее при использовании PRP. Полное закрытие дефекта регистрируется к 48 часам эксперимента. Однако результаты статистических тестов не выявили достоверных отличий по данному параметру между образцами 5,0 и 10,0% PRP. Учитывая известные положительные клинические эффекты PRP терапии и выявленные особенности протокола изучения влияний PRP, полученные данные не только расширяют воз- можности клинического применения данного способа для стимуляции процессов регенерации послеоперационных ран в клинике, в частности в оториноларингологии, стоматологии, челюстно-лицевой хирургии [25–27], но и открывают перспек- тивы изучения молекулярных механизмов положительных эффектов PRP как основу для совершенствования технологии. Заключение При оценке биологических эффектов PRP на культуру ФКЧ рекомендуется использовать 5,0–10,0% концентрации акти- вированного образца в культуральной среде, оптимальная посадочная плотность для данной культуры 25 000–50 000 кл./мл. Использование дополнительной активации CaCl2 после размораживания не влияло на результаты исследований, но облегчало работу с образцами плазмы. Наибольшая метаболи- ческая активность культуры ФКЧ зарегистрирована на 72 часа после внесения PRP.