Оценка жизнеспособности волосяных фолликулов в искусственных средах перед трансплантацией

 На текущий момент число мужчин, страдающих андрогенной алопецией, увеличивается с каждым днем и достигает, по данным различных источников, 80%.
Цель исследования: сравнить состояние волосяных фолликулов (ВФ), не подвергшихся влиянию внешней среды и после пребывания в различных искусственных средах, путем оценки функции натриево-калиевого насоса в мембране клеток методом электронной микроскопии.
Материал и методы. Проведено исследование ВФ, которые непосредственно перед исследованием извлекли из организма человека и которые пробыли в течение 6 часов в трех самых распространенных искусственных растворах. Во всех образцах проводилась электронная микроскопия фолликулов с помощью программы QUANTAX 70 и спектральная оценка химического состава.
Результаты. В ходе работы обнаружена корреляция между ионным составом ВФ и составом растворов, что может повлиять на жизнеспособность клеток. Выявлено, что наибольшее влияние на соотношение ионов калия и натрия внутри клетки оказал стандартный физиологический раствор, который традиционно является препаратом выбора для кратковременного сохранения забранных трансплантатов. Однако боль- шая концентрация натрия в окружающей среде приводит к повышению его концентрации внутри клетки и к «вымыванию» из нее ионов калия. При сравнении трех растворов для сохранения забранных фолликулов наилучшие результаты были получены при использовании раствора Димефосфона, в котором «вымывание» ионов было незначительным и соотношение калия и натрия практически сохранялось.
Заключение. По полученным изменениям ВФ можно косвенно судить и о процессах, происходящих во время хранения и, соответственно, проводить определение степени выживаемости для дальнейшей транспланта- ции. Для сохранения трансплантатов необходим раствор нейтрального состава, очищенный от ионов натрия.
Ключевые слова: андрогенная алопеция, ионный состав, трансплантация волос, электронная микроско- пия, химический анализ, волосяной фолликул, ионтранспортная система натрий-калиевый насос, забор фолликулов, фолликулярная единица
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Финансирование. Работа выполнена без спонсорской поддержки. 

Currently, the number of men suffering from androgenetic alopecia is increasing every day and, according to various sources, has reached 80%. The aim of the study was to compare the condition of hair follicles (HF) that had not been exposed to the external media and those that had been exposed to various artificial media by assessing the function of the sodium-potassium pump in the cell membrane using electron microscopy.
Material and methods. We studied HF that were extracted from the human body immediately before the study and kept for 6 hours in the three most common artificial solutions. All samples underwent electron microscopy of the follicles using the QUANTAX 70 software and spectral assessment of the chemical composition. Results. We found a correlation between the ionic composition of the HF and the composition of the solutions, which can affect cell viability. We found that standard saline solution, which is traditionally the agent of choice for short-term preservation of harvested grafts, had the greatest effect on the ratio of potassium and sodium ions inside the cell. However, a high concentration of sodium in the environment leads to an increase in its concentration inside the cell and to the «washout» of potassium ions. When comparing three solutions for preserving harvested follicles, the best results were obtained using the Dimephosphone solution, in which the «washout» of ions was insignificant, and the potassium-sodium ratio was practically preserved.
Conclusions. According to the observed changes in the HF, it is possible to indirectly assess the processes occurring during storage and, accordingly, determine the degree of viability for further transplantation. A neutral solution purified from sodium ions is required to preserve the grafts.
Key words: androgenetic alopecia, ionic composition, hair transplantation, electron microscopy, chemical analysis, hair follicle, sodium-potassium pump ion transport system, follicle sampling, follicular unit
Conflicts of interest. The authors have no conflicts of interest to declare.
Financing. The paper was done without sponsorship. 

Введение На текущий момент число мужчин, страдающих андрогенной алопецией, увеличивается с каждым днем и достигает, по дан- ным различных источников, 80% [1]. Отношение к внешнему виду в наше время становиться все более требовательным. Первоначально для лечения алопеции применялись исклю- чительно терапевтические методы [2–3]. К сожалению, все имеющиеся терапевтические методы лечения на приводят к удовлетворенности пациента конечным результатом [4–7]. Это заставляет все больше мужчин прибегать к хирургическим методам лечения. Наиболее популярным методом лечения ста- новится трансплантация волос [8–9]. Относительная новизна данной технологии подразумевает высокую степень точности проводимой операции и необходимость внедрения новых тех- нологий [10]. Особенно это касается забора и консервации трансплантата. Основным методом забора трансплантата явля- ется иссечение фолликулярной единицы (FUE – Follicular Unit Extraction) [11–13]. Данный метод позволяет достичь отличных результатов трансплантации, что в конечном итоге приводит к положительным косметическому и эстетическому результатам, к чему так стремятся пациенты. В качестве донорской зоны используют волосы, расположен- ные на задней или боковой частях головы. Волосы указанных областей устойчивы к воздействию гормонов, вызывающих андрогенную алопецию. В ходе операции производят извле- чение фолликулов волос (трансплантатов) из зоны донорства с последующим внедрением их в область облысения, где в дальнейшем они начинают расти и создавать новый волосяной покров, не подвергающийся гормональному воздействию [14]. Однако между забором трансплантата и пересадкой в зону облысения, как правило, существует промежуточный этап порядка 5–6 часов, во время которого извлеченные волосяные фолликулы (ВФ) хранятся в определенной среде и должны сохранить собственную жизнеспособность для дальнейшей пересадки в реципиентную зону [15]. В связи с этим возникает необходимость подбора оптимального искусственного раствора для максимального сохранения извлеченных ВФ, в котором они будут находиться до начала трансплантации [16–17]. Одной из основных причин гибели клеток является нарушение ионтранспортной системы и ионного баланса, необходимого для нормальной клеточной активности [18]. Окислительный стресс является последствием многих патологических состоя- ний, во время которых происходит повреждение клеток тканей. Активные формы кислорода приводят к утрате способности протомеров фермента Na+/K+АТФ-азы взаимодействовать друг с другом [19]. То есть можно говорить, что клетки с нарушением в работе данного мембранного белка являются поврежденными. Как известно, фосфолипидный слой клетки непроницаем. Для того чтобы ионы могли проникать через мембрану, необходимо создать разность концентраций ионов снаружи и внутри клетки, т.е. создать концентрационный градиент. Если он есть, то ион начинает двигаться из той части, где высокая концентрация, в ту часть, где концентрация низкая. Ионов натрия снаружи больше в 12 раз, ионов калия больше внутри примерно в 30 раз, анионов хлора больше снаружи примерно в 15 раз. Активность Na/K- насоса регулируется внутриклеточной концентрацией ионов натрия. Скорость работы насоса замедляется при снижении концентрации ионов натрия, подлежащих выводу из клетки [20]. В связи с этим можно сказать, что изменение содержания калия и натрия внутри клетки являются маркером ее повреждения [21]. Функция клеток волоса подчиняется общим законам функционирования всех клеток организма [22]. Следовательно, нарушение активности Na/K-насоса может привести к гибели ВФ. Одним из методов количественного определения содержа- ния ионов калия и натрия в клетках ВФ является электронная микроскопия [23–25]. Цель исследования: сравнить состояние ВФ, не подвергшихся влиянию внешней среды и после пребывания в различных искус- ственных средах, путем оценки функции натриево-калиевого насоса в мембране клеток методом электронной микроскопии. Материал и методы Проведено исследование здоровых ВФ, которые только забра- ли из организма пациента в затылочной области, и фолликулов, находящихся в течение 6 часов в различных искусственных средах. Для сравнения изучалось содержание калия, натрия, серы и хлора. Основными показателями, которые сравнивали в ходе иссле- дования, являлись натрий и калий внутри сосочка ВФ, т.е. в той части, которая является наиболее метаболически активной, а значит и в большей части подверженной факторам внешней среды. Область исследования локализовалась в районе сосочка ВФ, как можно ближе к корню, где и находятся метаболически активные клетки с ядрами. Для отделения активной части волоса исследовали содержание серы, т.к. основным протеином воло- сяного стержня является кератин, который содержит большое количество дисульфидных групп, состоящих из ионов серы, что обусловливает его прочность. В качестве контрольной группы взяли образец №1, который извлекли из организма непосредственно перед исследованием. В качестве образцов для сравнения были использованы волосы того же пациента, погруженные в 3 разных раствора, отлича- ющиеся по составу. Первый раствор состоял из физиологического раствора (натрия хлорида 0,9%) со вспомогательными веществами (образец №2): вода для инъекций до 1 л, натрия хлорид – 9 г; вспомогательные вещества: 0,1 М раствор хлористоводородной кислоты – pH 5,0–7,5, 0,1 М раствор натрия гидроксида – pH 5,0–7,5. Второй раствор – Димефосфон, относящийся к группе мета- боликов и обладающий антиацидотическим и антиоксидантным действиями (образец №3). Один литр раствора содержит: дей- ствующее вещество диметилоксобутилфосфонилдиметилат (димефосфон) – 150 г, вспомогательные вещества: дистилли- рованная вода – до 1 л. Третий раствор – раствор с АТФ (образец №4), в состав которого входит: динатрия аденозинтрифосфата тригидрат, в пересчете на аденозинтрифосфорную кислоту – 10,0 мг, натрия карбонат безводный – 4,4 мг, натрия гидрокарбонат – 8,0 мг, динатрия эдетата дигидрат – 0,2 мг, пропиленгликоль – 0,1 мл, вода для инъекций – до 5,0 мл, натрия хлорид – 2,25 мг. Все четыре образца ВФ подвергли электронной микроскопии с помощью программы QUANTAX 70 и провели спектральную оценку химического состава. 

Результаты Для наглядного определения правильности выбора волося- ного участка для исследования провели сравнение содержа- нии серы на различных уровнях волоса. После структурного разделения было проведено исследование качественного и количественного химического состава волос в образцах. На рис. 1 представлены спектральные изображения образцов ВФ, полученные при электронной микроскопии. По данным электронной микроскопии отмечается выраженное отличие между метаболически активными и пассивными участ- ками. Наличие в стержне волоса – образец №4 (АТФ) –ионов серы позволяет визуально отдифференцировать его от корня. В связи с тем, что баланс натрия и калия является важным показателем метаболизма клеток, особое внимание было уде- лено их соотношению. Спектральное изображение волоса при электронной микроскопии позволяет судить о содержании Na и K. На рис. 2 представлены спектральные изображения образцов с исследованием содержания ионов натрия и калия. Образец №1, использованный в качестве контроля (норма), характеризуется высоким внутриклеточным содержанием калия и относительно низкой концентрацией натрия. На изображениях, полученных с помощью электронной микроскопии, отчетливо визуализируется преобладание K+ в области фолликула по сравнению со стержнем волоса и окружающей средой. Средняя концентрация Na+ соответствует внешней среде. Следует под- черкнуть, что исследование проводилось in vitro в условиях относительного вакуума и сниженной концентрации натрия, что отличает экспериментальные условия от физиологических условий организма человека, где межклеточная жидкость явля- ется основным депо данного иона. В образце №2 наблюдается выраженное повышение концен- трации Na+ внутри фолликула с одновременным снижением уровня K+, что указывает на существенное нарушение работы натриево-калиевого насоса после 6 часов хранения волос в стан- дартном физиологическом растворе. Такое изменение ионного баланса свидетельствует о снижении жизнеспособности клеток и потере контроля мембранного потенциала. Образец №3, хранившийся в растворе с Димефосфоном, пра- ктически не продемонстрировал утраты калия, а концентрация натрия оставалась низкой, близкой к контрольным значениям. Это указывает на более стабильное поддержание ионного гоме- остаза и, вероятно, на бо`льшую сохранность метаболически активного участка фолликула по сравнению с образцом №2. В образце №4 также отмечается увеличение содержания Na+, связанное с присутствием солей натрия в растворе. Однако данное повышение выражено значительно слабее, чем в образце №2, где фолликулы содержались в чистом растворе 0,9% NaCl. Концентрация K+ снижается за счет выхода ионов из области сосочка фолликула, но полного «вымывания» калия не происходит, что указывает на частичное сохранение жизнеспособности клеток.

Помимо визуального анализа, проводилась качественная оценка содержания ключевых химических элементов фолли- кула (калий, натрий, сера и хлор). Процентное соотношение химических веществ в метаболически активном участке волоса представлено на рис. 3. При оценочном анализе данных спектроскопии содержание калия превышает количество хлора в 2,6 раза, а натрия в 4,3 раза, что закономерно, т.к. калий является основным внутри- клеточным катионом клетки. При углубленном исследовании на количественное соотношение исследуемых ионов отмечается, что в ВФ содержится больше всего ионов калия, превышающие ионы хлора на 63%, а натрия на 89% (табл. 1). Аналогичный анализ проведен по трем другим образцам (рис. 4): Также была проведена количественная оценка ионов в экс- периментальных группах (таблица). Анализ химического состава образца №2 показал выра- женное нарушение ионного баланса ВФ. Концентрация ионов калия снизилась более чем в 7 раз по сравнению с контролем (контроль: 93,2±3,8, образец №2: 13,1±4,5; p<0,001), тогда как  концентрации ионов натрия и хлора значительно возросли (Na: 163,7±4,1, Cl: 28,5±2,3; p<0,001 для обоих). Соотношение Na+/K+ достигло 5,8:1, а Na+/Cl- – 4,85:1. Такое соотношение указывает на выраженное нарушение работы натриево-калиевого насоса и электролитного гомеостаза, что может отражать потенциальную потерю жизнеспособности клетки. Повышение внутриклеточных концентраций Na+ и Cl-, сопровождающееся падением уровня K+, является характерным маркером осмотического стресса и нарушения мембранного потенциала, что прямо коррелирует с клеточной дисфункцией. В образце №3 наблюдалось общее снижение концентраций всех исследованных ионов, в меньшей степени K+ (Na: 15,9±4,6; K: 19,4±3,5; Cl: 0,5±3,1; p<0,001 по сравнению с контролем). Анализ образца №4, хранившегося в растворе с АТФ, выявил умеренное повышение концентрации ионов натрия (51,2±2,9) и незначительное увеличение концентрации хлора (11,3±4,5) при снижении уровня калия (9,7±1,3) по сравнению с контр- олем. Соотношение Na+/K+ и Na+/Cl-, несмотря на частичное восстановление, остается выше физиологического уровня, что отражает частичное, но недостаточное поддержание работы натриево-калиевого насоса. Таким образом, присутствие АТФ в среде позволяет лишь частично стабилизировать ионный баланс, снижая экстремальное накопление натрия и хлора, но не полностью предотвращает потенциальную потерю жизне- способности клетки. В ходе исследования установлено, что наибольшее влияние на внутриклеточное соотношение ионов калия и натрия оказывают условия хранения фолликулов в стандартном физиологическом растворе, который традиционно используется для кратковре- менного поддержания трансплантатов. Высокая концентрация натрия в окружающей среде приводит к его значительному накоплению внутри клетки и одновременному вымыванию калия, что нарушает электролитный гомеостаз и может снижать жизнеспособность клеток. Сравнение трех различных растворов для кратковременного сохранения забранных ВФ показало, что наилучшие результаты достигаются при использовании раствора Димефосфона. В этом растворе «вымывание» ионов калия было минимальным, а соотношение калия и натрия сохранялось близким к физиоло- гическому, что свидетельствует о более стабильной поддержке ионного баланса и потенциала жизнеспособности клеток. Заключение На данный момент отсутствуют стандартизированные данные о выживаемости фолликулов при погружении в различные рас- творы, и клиницисты используют индивидуальные протоколы. Систематическое изучение влияния разных сред на ионный состав и жизнеспособность ВФ позволит выработать научно обоснован- ные рекомендации для оптимизации кратковременного хранения трансплантатов. По итогам проведенного исследования необходи- мо отметить, что наилучшим вариантом раствора для содержания забранных трансплантатов является раствор, не содержащий ионов натрия ни в каком виде. Это позволяет сделать вывод, что для сохранения трансплантатов необходим раствор нейтрального состава, очищенный от ионов натрия. Альтернативой (в качест- ве исходной точки для проведения дальнейших исследований) может быть использован раствор с повышенным содержанием калия для того, чтобы уравновесить соотношение ионов, и сохра- нить в клетке собственный потенциал покоя, что важно не только для возбудимости, но и для метаболизма.