Обоснование использования раман-флуоресцентной спектроскопии в экспресс-диагностике рака гортани

Введение. Рак гортани является одним из наиболее распространенных видов злокачественных новообра- зований головы и шеи. Особенно часто встречается плоскоклеточный рак головы и шеи различной лока- лизации, в т.ч. и гортани. Ежегодно от рака умирают огромное число людей, обратившихся за медицинской помощью несвоевременно, на поздней стадии развития заболевания. Исключением не является плоско- клеточная карцинома гортани. Поиск оптических методов диагностики, позволяющих идентифицировать онкологический процесс на ранней его стадии, относится к одним из важнейших стратегических направле- ний клинической медицины и общественного здоровья в целом. Подобным методам могут соответствовать раман-флуоресцентные медицинские технологии. Цель исследования заключалась в научно-практическом обосновании использования раман-флуорес- центной спектроскопии в ранней экспресс-диагностике рака гортани.
Материал и методы. Всего были обследованы 83 пациента с установленным диагнозом «Рак гортани». Были проанализированы спектры интактной слизистой оболочки гортани, анатомических структур гортани при раке и предраке. Оценены индивидуальные особенности полос комбинационного рассеяния света и флуоресцентных сигналов в норме, дисплазии и плоскоклеточной карциноме гортани. Для сопоставления данных раман-флуоресцентной спектроскопии применялся гистологический метод исследования. В ходе исследования оценивали чувствительность и специфичность метода. Для снятия спектров применяли лазерную установку с использованием как флуоресцентной, так и рамановской составляющих, с длиной волны 532 нм. Измерения проводили немедленно после удаления ткани гортани (1–5 секунд), вовлеченной в злокачественный процесс. Результаты. В ходе исследования с использованием раман-флуоресцентной спектроскопии получены инди- видуальные спектральные характеристики тканей гортани в норме и при раке гортани, а также при дисплазии (переходном процессе, предраке). Как было отмечено в ходе исследования, в выше обозначенных группах имеются различия как в сигналах флуоресценции, так и в полосах комбинационного рассеяния света, что может служить вспомогательным инструментарием для клинициста при ранней диагностике рака гортани.
Выводы. В перспективе раман-флуоресцентные медицинские технологии могут быть использованы с це- лью ранней экспресс-диагностики опухолевых заболеваний гортани. Клиническая медицина, общественное здоровье и здравоохранение в целом нуждаются в развитии технологий подобного рода с целью повышения качества и эффективности диагностики и лечения заболеваний на стадии их инициации.
Ключевые слова: раман-флуоресцентные медицинские технологии, рак гортани, плоскоклеточная карцинома гортани, ранняя диагностика рака
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Финансирование. Работа выполнена без спонсорской поддержки.

Introduction. Laryngeal cancer is one of the most common types of head and neck malignant tumors. Squamous cell carcinoma of the head and neck of various localizations, including the larynx, is especially common. Every year, a large number of people die of late-stage cancer due to untimely medical attention. Laryngeal squamous cell carcinoma is no exception. The search for optical diagnostic methods that allow identifying the tumor development at its early stage is one of the most important directions for clinical medicine and public health in general. Raman fluorescence medical technologies can provide such methods. The aim of the study: To provide a scientific and practical rationale for the use of Raman fluorescence spectroscopy in the early diagnostics of laryngeal cancer. Material and methods. A total of 83 patients with a diagnosis of laryngeal cancer were examined. The spectra of the intact laryngeal mucosa, the anatomical structures of the larynx in cancer and precancer were analyzed. Individual features of Raman bands and fluorescence signals were evaluated for normal epithelium, dysplasia and squamous cell carcinoma of the larynx. To correlate the Raman fluorescence spectroscopy data, pathological examination was used. We evaluated the sensitivity and specificity of the method. A laser setup using both fluorescence and Raman components, with a wavelength of 532 nm, was used to take spectra. Measurements were taken immediately after removal of the laryngeal tissue (1-5 seconds) involved in the malignant process. Results. Using Raman fluorescence spectroscopy, individual spectral characteristics were obtained for both normal laryngeal tissues and laryngeal cancer, as well as for dysplasia (transitional process, precancer). The study revealed that there were differences in both fluorescence signals and Raman bands in the above groups, and the method may serve as an auxiliary tool for the clinician in the early diagnosis of laryngeal cancer. Conclusion. In the future, Raman fluorescence medical technologies may be applied for the purpose of early express diagnostics of laryngeal tumors. Clinical medicine and public health in general need the development of such technologies to improve the quality and efficiency of diagnostics and treatment at the initial stages of diseases. Keywords: Raman fluorescence medical technologies, laryngeal cancer, squamous cell carcinoma of the larynx, early diagnosis of cancer Conflicts of interest. The authors have no conflicts of interest to declare. Funding. There was no funding for this study

Введение Ежегодно в Российской Федерации регистрируется более 600 тыс. злокачественных новообразований (ЗНО) и приблизительно 300 тыс. смертей от их развития [1]. Рак гортани относится к одним из наиболее распространенных видов плоскоклеточного рака головы и шеи [2–6]. Согласно статистическим данным, в США ожидается ежегодно 13 тыс. новых случаев вышеупо- мянутой патологии при 70% выживаемости [7]. Рак гортани занимает 20-е место в структуре самых распространенных типов ЗНО; каждый год в мире обнаруживается более 150 тыс. новых его случаев [8]. Кроме того, данный вид опухолевого процесса встречается в трети случаев регистрации ЗНО головы и шеи с плоскоклеточной трансформацией клеток [9]. Оптимальное лечение данной патологии требует междисциплинарного под- хода с участием специалистов различных направлений [10]. Определение биомаркеров опухолевых заболеваний относит- ся к одной из важнейших задач клинической практики [11, 12]. Поздняя диагностика и значительное снижение качества жизни пациентов при раке различной локализации служат допол- нительным побудительным мотивом для разработки ранних методов диагностики рака [8, 13, 14]. В данном случае ранняя экспресс-диагностика опухолевых заболеваний ЛОР-органов не является исключением. В частности, пристального внимания заслуживает поиск маркеров онкологического процесса при раке гортани [15]. Помимо всего прочего, большое значение прио- бретает четкое соблюдение границ резекции опухолевой ткани во время операции во избежание рецидива патологического процесса, соответственно необходима разработка точного и быстрого интраоперационного определения границ злокачест- венной опухоли [16, 17]. В современных научных трудах описаны случаи использова- ния комбинационного рассеяния света в сочетании с машинным обучением и соответствующими аппаратно-программными ком- плексами в отношении идентификации плоскоклеточного рака гортани [18]. Вопрос повышения чувствительности и специфич- ности методов ранней индикации патологического процесса при раке гортани остается востребованным, ввиду все более частой регистрации случаев рецидива заболевания [19]. Несмотря на применение на практике таких методов, как гистологический [20], иммуногистохимический [14] и метод полимеразной цеп- ной реакции [21], перед учеными всего мира стоит важный вопрос ускорения процесса идентификации онкологического процесса в режиме реального времени. Поиск современных методов раннего выявления онкологических заболеваний, в т.ч. рака гортани с использованием высокочувствительных, высокоспецифичных, точных, быстрых, неинвазивных методов диагностики относится к одной из важнейших задач обществен- ного здоровья и здравоохранения [22–24]. В качестве подобных методов диагностики интерес представляют собой раман-флуоресцентные медицинские технологии [25–30]. В настоящее время комбинационное рассеяние света применяется в диаг- ностике опухолевых заболеваний ЛОР-органов, в т.ч. при раке гортани [31, 32]. На сегодняшний день для использования в клинической практике данных методов существуют определенные слож- ности, такие как высокая стоимость оборудования, отсутствие врачей, владеющих технологией и, соответственно, обучения в данной области, недостаточная разработанность алгоритмов диагностики опухолевых и воспалительных заболеваний ЛОР- органов, включая рак гортани как одного из наиболее часто встречающихся видов онкологической патологии в практике оториноларинголога и онколога. Цель исследования заключалась в научно-практическом обо- сновании использования раман-флуоресцентной спектроскопии в ранней экспресс-диагностике рака гортани. Материал и методы Всего были обследованы 83 пациента, страдающих раком гор- тани на различной его стадии. Были получены спектры интактной слизистой оболочки гортани, окружающей опухолевую ткань, ткани гортани при дисплазии (предраке), спектры опухолевой ткани гортани при плоскоклеточной карциноме при различных ее типах (высокодифференцированном, низкодифференциро- ванном). Проанализированы полосы комбинационного рассея- ния света и флуоресцентные сигналы в норме, при дисплазии и плоскоклеточной карциноме гортани. Для снятия спектров применялась лазерная установка с использованием как флуо- ресцентной, так и рамановской составляющих, с длиной волны 532 нм. Измерения проводили немедленно после удаления ткани гортани (1–5 секунд), вовлеченной в злокачественный процесс. В ходе исследования применялась классификация ВОЗ, при- нятая в Париже в 2005 г., согласно которой выделяют 3 стадии ларингеальной интраэпителиальной неоплазии плоскоклеточно- го эпителия (ЛИН): ЛИН 1, ЛИН 2, ЛИН 3: слабая дисплазия, уме- ренная дисплазия, выраженная дисплазия и рак in situ. Оценка корреляции метода раман-флуоресцентной спектроскопии с результатами гистологии в данном исследовании проводилась путем сравнения индивидуальных спектральных характери- стик ткани в норме, при раке гортани и данных патоморфо- логического исследования с определением краев резекции в 100% случаев. Расчет выборки проводился по общепринятой формуле, что было достаточно для получения достоверных и воспроизводимых результатов исследования. Результаты Основной отличительной особенностью интактной ткани, окружающей ткань гортани, вовлеченной в опухолевый процесс при плоскоклеточной карциноме, как показано на рис. 1, является то, что в данном случае отсутствуют пики на величинах волновых чисел 1100 см-1 и 1500–1650 см-1, которые регистри- руются на всех стадиях течения плоскоклеточного рака гортани Всего были обследованы 24 пациента, 24х20=480 спектров. 2000 на 800 см-1, 900, 1000, 1250, 1400, 1600, 1700, 2700 см-1. Первый Как мы видим, отмечается небольшой пик на величине 2900 максимум – на 13200 ОЕ, второй максимум – на 13000 ОЕ, третий см-1, после которого регистрируется дополнительный подъем максимум (пик основной) – на 9000 ОЕ. 1000 флуоресценции. У 11 пациентов с плоскоклеточной карциномой На рис. 4 показано, что интенсивность основных пиков ниже, 500 1000 1500 2000 гортани, (недифференцированный тип, со средней степенью 2500 3000 3500 4000 отмечается менее выраженная их конфигурация, с более гладки- raman shift [1/cm] ороговения) было проанализировано 220 спектров с поверхно- ми переходами, однако данные пики выделяются на общем фоне сти тканей гортани. В данном случае были зарегистрированы генерализованного сигнала флуоресценции. Отмечаются пики рамановские пики на 1250, 1400, 1900/см. Зарегистрированы 2 на 1100 см-1, 1500, 2900 см-1, с максимальной интенсивностью подъема флуоресценции с максимальными пиками на величинах флуоресценции на 6500 см-1, 6900 и 4800 см-1. У 14 пациентов 11500 и 12100 относительных единиц (ОЕ) (визуализировалась было зарегистрировано 280 спектров. максимальная интенсивность флуоресценции). Для постановки диагноза помимо метода клинического обсле- У 12 пациентов проанализировано 240 спектров. Как отмечено дования пациентов и раман-флуоресцентной спектроскопии на рис. 2, регистрируется 2 сигнала флуоресценции с макси- применялся гистологический метод исследования. Проведение мумом на 1200 см-1 (8500 ОЕ), 2100/см (12000 ОЕ). При этом гистологического исследования. В ходе исследования оценивали Обсуждение 14000 чувствительность, специфичность метода, которые составили 100 и 95,8% соответственно. Полученные результаты коррелируют с данными мировой 12000 Как было отмечено в ходе исследования, чем более высоко- литературы. Так, описано использование трансназальной рама- дифференцированным был тип плоскоклеточной карциномы, 10000 новской спектроскопии для дифференциации опухолевой и тем более спектр коррелировал со спектром интактной ткани гортани, и, наоборот, при низкодифференцированном типе отмечалась более сглаженная спектральная кривая, более мощ- ный сигнал флуоресценции. counts per frame интактной ткани при проведении эндоскопического иссле- 8000 дования в режиме «реального времени» (в диапазоне волно- вых чисел 2800–3020 см-1) в области анатомических структур 6000 гортани. Данное исследование показало, что рамановская Также большое значение приобретает процесс ороговения 4000 спектроскопия обладает потенциалом для проведения неин- при плоскоклеточной карциноме гортани. При плоскоклеточ- вазивной диагностики и обнаружения рака гортани в режиме 2000 ном раке гортани без ороговения и с ороговением отмеча- реального времени на молекулярном уровне [33]. Спектры ются спектральные различия, что в перспективе может быть комбинационного рассеяния света в диапазоне 800–1800 см-1 из 0 использовано с целью определения типа опухоли. Однако для 500 1000 1500 2000 различных участков ткани, снятые немедленно после операции 2500 3000 3500 4000 получения референсных значений в норме, при раке и предраке raman shift [1/cm] в течение 5 секунд, могут иллюстрировать происходящие в необходимо проведение исследования на большей выборке с ткани изменения с диагностической чувствительностью 88,0% последующей обработкой и вычитанием сигнала флуоресценции и специфичностью 91,4% в отношении идентификации ЗНО из генерализованного спектра, что и предстоит выполнить в гортани [34]. Проведение волоконно-оптической рамановской последующих исследованиях. спектроскопии в диапазоне 800–1800 см-1 для диагностики рака гортани in vivo в ходе эндоскопического исследования проде- монстрировало эффективность в отношении дифференциации тканей гортани при раке и в норме. Спектры комбинационного рассеяния интактной и опухолевой тканей гортани существенно различаются, что может быть связано с различным количест- вом и соотношением белков, липидов, нуклеиновых кислот и содержания связанной воды в клетках анатомических структур гортани [35]. Таким образом, клиническая практика на сегодняшний день нуждается в разработке точных методов диагностики рака in situ и экспресс-идентификации при хирургическом вмешательстве с целью четкого определения границ резекции ЗНО, что служит ключом к снижению заболеваемости и смертности от рака. В результате проведенного исследования было отмечено, что метод раман-флуоресцентной спектрометрии в перспективе может быть использован с целью экспресс-идентификации опухолевого и предопухолевого процесса при раке гортани, в частности при плоскоклеточной карциноме гортани на раз- личных ее стадиях и при различных типах опухоли. Учитывая, что спектры тканей в норме и при раке гортани различаются, клиницисту необходима база спектров, позволяющая иденти- фицировать злокачественный рост еще при инициации предопу- холевого процесса, т.к. на такой стадии пациенты, как правило, еще не обращаются к врачу, но могут обследоваться в рамках диспансеризации. Заключение Резюмируя вышесказанное, следует отметить, что при разра- ботке специального алгоритма комбинированной диагностики раман-флуоресцентная спектроскопия может быть использо- вана в качестве скрининговой методики с целью ранней экс- пресс-идентификации рака гортани с последующим примене- нием в клинической практике, что является целью дальнейших исследований.