Морфологические изменения в тканях пародонта под влиянием клинической методики репрограммирования макрофагов

Цель – определение морфологических изменений в тканях пародонта под влиянием новой клинической методики репрограммирования макрофагов с помощью аутосыворотки крови и оценка ее эффективности на клеточном уровне.
Материал и методы. С помощью гистоморфологического и морфометрического методов изучены срезы тканей десны 20 добровольцев в возрасте от 35 до 44 лет – больных хроническим генерализованным паро- донтитом средней степени тяжести – в начале и спустя месяц консервативной подготовки к хирургическому лечению. В основной группе и группе сравнения были по 4 мужчин и 6 женщин в каждой. Подготовка вклю- чала индивидуальную коррекцию гигиены полости рта, профессиональную гигиену, избирательное пришли- фовывание и временное шинирование подвижных зубов по показаниям, а также местное консервативное противомикробное и противовоспалительное лечение. В основной группе, помимо этого, дополнительно реализовывали новый метод клинического репрограммирования макрофагов in vivo, а в группе сравнения этого не делали. Основываясь на экспериментальных исследованиях, разработали клиническую технологию репрограммирования макрофагов в тканях пародонта из поддерживающего воспаление фенотипа M1 в противовоспалительный фенотип М2. Она заключается в получении аутологичной обедненной клеточными элементами, но содержащей много факторов репрограммирования макрофагов, сыворотки венозной крови. Такую сыворотку получали непосредственно возле больного путем двойного центрифугирования цельной крови с «мягким стартом» при 10 000 об/мин и сразу же вводили подслизисто в области переходной складки в участках воспаления. Под влиянием такой аутосыворотки происходит постепенное репрограммирование макрофагов в фенотип М2.
Результаты. Гистоморфологические исследования показали отсутствие воспалительной инфильтрации в основной группе после окончания лечения. За этот период состав инфильтрата изменился: уменьшилось число нейтрофильных лейкоцитов: в среднем – на 31,0%, лимфоцитов – на 11,2%, плазматических клеток – на 6,2%, макрофагов – на 4,8%. Увеличилось число фибробластов. В процентном соотношении стали прео- бладать макрофаги фенотипа М2 (82,3%) против 17,7% фенотипа M1. Морфологический индекс макрофагов в основной группе изменился с 2,9 в начале до 0,2 в конце периода наблюдения, т.е. в 14,5 раза. В группе сравнения, где методика не использовалась, в конце наблюдения морфологический индекс составил 0,6, что также подтверждает увеличение пропорции фенотипа М2 макрофагов, но в меньшей степени, чем в основной группе – только в 4,8 раза.
Заключение. В ходе гистоморфологического и морфометрического сравнительного исследования биоптатов десны выявили высокую эффективность новой клинической методики репрограммирования макрофагов тканей пародонта в противовоспалительный фенотип М2, которую можно использовать в дополнение к традиционному комплексному лечению воспалительных заболеваний пародонта.
Ключевые слова: пародонт, хронический генерализованный пародонтит, воспаление, аутосыворотка крови, репрограммирование макрофагов, гистоморфологическое исследование
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Финансирование. Работа выполнена без спонсорской поддержки.

Objective of the study – to study morphological changes in periodontal tissues under the influence of a novel clinical technique of macrophages reprogramming using autologous blood serum and to assess the method effectiveness at the cellular level.
Material and methods. Using histomorphology and morphometry, we studied gingival tissue sections of 20 volunteers from 35 to 44 years old – patients with moderate chronic generalized periodontitis – obtained at the beginning and after one month of conservative preoperative preparation. There were 4 men and 6 women in each of the main group and comparison group. The preparation included individual and professional oral hygiene meausers, selective grinding and temporary splinting of movable teeth where indicated, as well as local conservative anti-microbial and anti-inflammatory treatment. In addition, a novel in vivo method of clinical macrophage reprogramming was implemented in the main group, but not in the comparison group. Based on the experimental studies, we developed a clinical technology for reprogramming macrophages in periodontal tissues from the inflammation-supporting phenotype M1 to the anti-inflammatory phenotype M2. The method consists in obtaining autologous venous blood serum depleted of cellular elements but containing many factors of macrophage reprogramming. Such serum was obtained directly beside the patient by double centrifugation of the whole blood with “soft start” at 10 000 rpm and injected immediately submucosally in the mucogingival fold in the areas of inflammation. Under the influence of the autologous serum, there is a gradual reprogramming of macrophages into the M2 phenotype.
Results. Histomorphological assessment showed the absence of inflammatory infiltration in the main group after the end of treatment. The composition of the infiltrate changed during this period: the mean decrease in the number of neutrophilic leukocytes reached 31,0%, lymphocytes – 11,2%, plasma cells – 6,2%, macrophages – 4,8%. The number of fibroblasts increased. Macrophages of M2 phenotype became predominant (82,3%) over the M1 phenotype (17,7%). The morphological index of macrophages in the main group decreased from 2,9 at the beginning to 0.2 at the end of the observation period, i.e. by 14,5 times. In the comparison group, where the technique was not used, the morphological index was 0.6 at the end of observation, which also confirms an increase in the proportion of M2 phenotype of macrophages, but to a lesser extent than in the main group – only by 4,8 times.
Conclusion. Histomorphological and morphometric comparative study of gingival biopsy specimens revealed high efficiency of the new clinical technique of periodontal tissue macrophage reprogramming into anti-inflammatory M2 phenotype. The method can be used in addition to traditional complex treatment of inflammatory periodontal disease. Keywords: periodontium, chronic generalized periodontitis, inflammation, autologous serum, macrophage reprogramming, histomorphological study.

Conflicts of interest. The authors have no conflicts of interest to declare.
Funding. There was no funding for this study
For citation: Rumyantsev V.A., Denis A.G., Shimansky Sh.L., Shestakova V.G., Donskov S.A., Blinova A.V. Morphological changes in periodontal tissues under the influence of clinical methods of reprogramming macrophages. Head and neck. Russian Journal. 2022;10(4):8–15
The authors are responsible for the originality of the data presented and the possibility of publishing illustrative material – tables, drawings, photographs of patients.

Введение

Особенностью воспалительной реакции в тканях пародонта является ее опосредование неадекватной извращенной иммунологической реакцией, приводящей либо к хронизации процесса (хронический пародонтит), либо к его бурному течению (агрес- сивный пародонтит) [1, 2]. Первая линия защиты непосредственно связана с клеточным компонентом, в частности с активностью нейтрофилов и макрофагов в зоне воспаления. Макрофаги дифференцируются из моноцитов периферической крови и представляют собой клетки, которые в отличие от округлых моноцитов имеют неправильные очертания и морфологически полиморфны [3–5].

В последние годы хорошо изучен механизм активации макрофагов, в т.ч. при распространенной общей хронической патологии: обструктивной болезни легких, атеросклерозе кровеносных сосудов, онкологических заболеваниях [6–9]. При этом четко сформировалось представление о дивергентной поляризации макрофагов, т.е. их способности, исходя из характеристик окружающей среды и внешних сигналов, проявлять либо про-, либо противовоспалительную активность [10–13]. Выделяют два полярных типа активированных макрофагов: M1 и М2 [14, 15]. Активация макрофагов в фенотип M1 способствует увеличению секреции провоспалительных цитокинов, как например интерлейкина-12 (ИЛ-12) [16, 17]. Такие макрофаги инициируют воспаление, при котором они проявляют цитотоксическую и бактерицидную активность. Альтернативная активация макрофагов в фенотип М2 происходит под влиянием иммунокомплексов и ИЛ-1β, ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-13, а также грибковой и гельминтной инфекции [2]. Существуют различные способы культивирования «поляризированных» макрофагов, репрограммирования макро- фагов, все они реализуются в условиях лаборатории клеточных культур in vitro [4].

Ранее, основываясь на экспериментальных исследованиях [18] и предположив, что репрограммирование макрофагов возможно проводить непосредственно в тканях in vivo, мы обо- сновали и разработали клиническую технологию репрограммирования макрофагов в тканях пародонта из поддерживающего воспаление фенотипа M1 в противовоспалительный фенотип М2. Она заключается в получении аутологичной обедненной кле- точными элементами, но содержащей большое число факторов репрограммирования макрофагов сыворотки венозной крови. Такую сыворотку получают непосредственно возле больного путем двойного центрифугирования цельной крови с «мягким стартом» при 10 000 об/мин и сразу же вводят подслизисто в области переходной складки в полости рта в участках воспале- ния тканей пародонта. Под влиянием обедненной клеточными элементами аутосыворотки происходит постепенное репрограм- мирование макрофагов в фенотип М2 [19, 20].

Целью исследования явилось определение морфологических изменений в тканях пародонта под влиянием новой клинической методики репрограммирования макрофагов и оценка ее эффективности на тканевом уровне.

Материал и методы

Для сравнительной оценки эффективности разработанной методики клинического репрограммирования макрофагов паро- донта осуществили клинико-морфологическое эксперимен- тальное исследование с участием 20 добровольцев – больных хроническим генерализованным пародонтитом средней степени тяжести (код МКБ: К05.31), не имеющих сопутствующих общих соматических заболеваний. После обследования всем больным проводили комплексное пародонтологическое лечение. Однако период нашего наблюдения и обследования больных охватывал только первый месяц, когда у них осуществляли подготовку к последующему хирургическому лечению с целью устранения патологических пародонтальных карманов. Эта подготовка включала индивидуальную коррекцию гигиены полости рта, профессиональную гигиену, избирательное пришлифовывание зубов и временное шинирование подвижных зубов по пока- заниям, а также местное консервативное противомикробное и противовоспалительное лечение в соответствии с клиниче- скими рекомендациями, утвержденными Стоматологической ассоциацией России (СтАР) 30.09.2014. Больных произвольно разделили на 2 равные по численности и половому составу группы: основную и группу сравнения (по 4 мужчин и 6 женщин в каждой). В основной группе помимо указанного выше лечения дополнительно реализовывали метод клинического репрограммирования макрофагов in vivo, а в группе сравнения этого не делали. Все добровольцы были в возрасте от 35 до 44 лет (средняя возрастная группа ВОЗ). Исследование одобрено Этическим комитетом Тверского ГМУ 25.04.2016, каждый из добровольцев давал письменное информированное согласие.
До начала лечения и в конце периода подготовки больных к хирургическому лечению (через месяц) проводили биопсий- ное морфологическое исследование тканей десны. Иссекали фрагменты многослойного плоского неороговевающего эпителия десны с подлежащими тканями в тех местах, где это не могло принести ощутимого вреда для больного. После этого их фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина (рН=7,2), затем проводили в изопропиловом спирте с добавлением «Iso-Prep» (ООО «ЭргоПродакшн», Россия) и заливали в гомогенизированную парафиновую среду «HISTOMIX» (ООО «ЭргоПродакшн», Россия), формируя блоки. Из парафиновых блоков изготавливали гистологические препараты толщиной 5–6 мкм и окрашивали гематоксилином и эозином. Кроме этой методики, применяли гистохимическую окраску по Вейгерт–Ван– Гизону. Эта окраска применялась для выявления эластических и коллагеновых волокон, соединительной ткани, клеточных элементов и ядер.
Морфологический материал был разделен на 3 группы: от всех больных до начала лечения (1) и спустя месяц от его начала от больных группы сравнения (2) и основной группы (3). При изучении микроскопических препаратов оценивали динамику изменений воспалительной реакции и особенности регене- рации тканей. Микроскопическое исследование изменений в тканях, фоторегистрацию и морфометрические исследования проводили с применением исследовательского тринокулярного микроскопа «Nikon Eclipse 50i» (Nikon, Япония), специализиро- ванной цифровой фотокамеры «Nikon DS-Fi2» (Nikon, Япония) и персонального компьютера, работающего под управлением операционной системы Windows 7 с использованием специа- лизированных морфометрических программ «NIS-Elements» (Nikon Instruments Inc., США) и «BioVision Professional» (BioVision Inc., США).

При морфометрическом исследовании материала до и после лечения определяли:
– плотность воспалительного инфильтрата (путем подсчета
числа клеток в 10 полях зрения в препаратах при увеличении
×400);
– состав клеточного инфильтрата с подсчетом нейтрофильных
лейкоцитов, лимфоцитов, фибробластов, фиброцитов, плаз- матических клеток и макрофагов (в %) в 10 полях зрения с каждого микропрепарата при увеличении ×400.
Также подсчитывали процентное соотношение фенотипов макрофагов M1 и М2. Основными отличительными морфологическими характеристиками этих фенотипов макрофагов являются: для M1 – округлая форма, для М2 – фибробластоподобная форма, морфологический индекс М1/М2 в норме для тканей пародонта – от 0,09 до 1,13. Статистический анализ цифровых показателей, имеющих нормальное распределение, проводили с помощью t-критерия. Проверку на нормальность распределения оценивали при помощи критерия Шапиро–Уилкса. Значимыми считали различия при р<0,05.

Результаты обсуждение

Морфологическая характеристика гистопрепаратов десны до лечения. До лечения наблюдаемая картина в микропрепаратах, полученных от обеих групп больных, не отличалась. В многослойном плоском ороговевающем эпителии выявлялись акантоз и паракератоз. В ряде наблюдений отмечались истинные эрозивные дефекты с тканевым детритом на поверхности. В подлежащей соединительнотканной строме наблюдалась выраженная воспалительная инфильтрация, отеки, полнокровные сосуды и очаговые кровоизлияния (рис. 1А).

Морфометрические исследования показали, что воспалительный инфильтрат достаточно выражен (рис. 1Б). Плотность клеточного инфильтрата составляла 483±12,4 клеток в поле зрения, и он был представлен на 34,7±1,6% нейтрофильными лейкоцитами, лимфоцитами – на 37,1±1,2%, плазматическими клетками – на 10,7±0,8%, фибробластами – на 6,1±0,3%, макрофагов было обнаружено 11,4±0,4% (таблица). При этом значительно преобладали макрофаги фенотипа M1 (74,4%) по сравнению с фенотипом М2 (25,6%, рис. 1В).
Таким образом, до начала лечения патоморфологические изменения в тканях десны больных характеризовались выраженной воспалительной инфильтрацией, изменениями со стороны соединительнотканного матрикса и многослойного плоского неороговевающего эпителия, значительным преобладанием M1 (противовоспалительного) фенотипа макрофагов.
Морфологическая характеристика гистопрепаратов десны через месяц от начала лечения в группе сравнения. В строме под многослойным плоским неороговевающим эпителием выявлялись полнокровные сосуды (рис. 2А), в отдельных наблюдениях – гиперкератоз эпителия (рис. 2Б) и липоматоз в подлежащей строме (рис. 2В). При окраске по Вейгерт–Ван– Гизону для выявления эластических волокон соединительной ткани наблюдали коллагеновые волокна и фиброциты. Однако среди коллагеновых волокон было обнаружено большое число сосудов, что является морфологическим признаком неполного созревания соединительной ткани (рис. 2Г).
В ряде случаев наблюдалось замедление созревания сое- динительной ткани, и на момент контрольного морфологического исследования было отмечено формирование только грануляционной ткани с умеренной воспалительной реакцией и выраженной васкуляризацией (рис. 2Д). Морфометрические исследования показали плотность клеточного инфильтрата – 127±3,2 клеток в поле зрения, а изменения его состава по сравнению с первичным исследованием заключалось в уменьшении числа нейтрофильных лейкоцитов на 13,2%, лимфоцитов – на 10,5%, плазматических клеток на – 8,4%, макрофагов – на 5,8%. Число фибробластов, напротив, увеличилось на 9,5% и появились фиброциты – 44,2±1,5%. Соотношение макрофагов М1/М2 фенотипов: 36,2 к 63,8% соответственно.

Таким образом, в группе сравнения без применения клинической методики репрограммирования макрофагов через месяц от начала традиционного лечения наблюдалось стихание вос- палительной реакции и формирование соединительнотканного матрикса в строме с преобладанием М2 (тканевого ремодели- рующего) фенотипа макрофагов. Однако имелись морфологи- ческие признаки неполного созревания соединительной ткани. Также в ряде наблюдений выявлялись патоморфологические изменения, которые можно характеризовать как осложнения (гиперкератоз эпителия и липоматоз стромы).

Морфологическая характеристика гистопрепаратов десны через месяц от начала лечения в основной группе. При исследовании микропрепаратов патологических изменений в многослой- ном плоском неороговевающем эпителии не выявлено. В подлежащей строме воспалительная инфильтрация не наблюдалась (рис. 3А). При окраске по Вейгерт–Ван–Гизону обнаруживали зрелые коллагеновые волокна и фиброциты (рис. 3Б, 3В).

Морфометрические исследования показали отсутствие воспалительной инфильтрации. Плотность клеточного инфильтрата в соединительнотканном матриксе стромы составила 85±2,7 клеток в поле зрения. Состав инфильтрата по сравне- нию с первичным исследованием изменился: уменьшилось число нейтрофильных лейкоцитов на 31,0%, лимфоцитов – на 11,2%, плазматических клеток – на 6,2%, макрофагов – на 4,8%. Число фибробластов увеличилось на 6,8%, а число фиброцитов достигло 49,4±1,9%. Подсчет процентного соотношения выявил значительное преобладание фенотипа М2 макрофагов: 82,3% против 17,7% фенотипа M1.

Таким образом, в биоптатах основной группы больных гистологическая картина характеризовалась отсутствием изменений со стороны эпителия и воспалительной реакции, полным созреванием соединительной ткани с формированием полноценного соединительнотканного матрикса в подлежащей строме и значительным преобладанием М2 фенотипа макрофагов.

Обсуждение

Известно, что биотехнологии искусственного репрограммирования макрофагов in vitro: «сывороточная» и «цитокиновая» [16] реализуются в условиях лаборатории клеточных культур в течение от полутора до 6 суток. При этом мононуклеарные клетки выделяют из гепаринизированной венозной крови цен- трифугированием и затем культивируют в специальной среде, дополненной раствором L-глутамина, специального буфера, гентамицина, и другими компонентами. В научной литературе до настоящего момента не было сведений о применении технологии репрограммирования макрофагов в клинике при комплексном пародонтологическом лечении.Проведенное контролируемое исследование подтвердило нашу гипотезу о возможности искусственного клинического репрограммирования макрофагов in vivo в тканях пародонта, т.е. в очаге хронического воспаления в условиях реального времени и реальной среды функционирования этих клеток. Тот факт, что под влиянием обедненной клеточными элементами аутосыворотки крови в основной группе больных в тече- ние месяца произошло существенное увеличение пропорции макрофагов фенотипа М2 при одновременном уменьшении пропорции M1 фенотипа соответствует имеющимся в литера- туре предположениям [19] и свидетельствует об эффективности новой предложенной методики. Процентное содержание макрофагов в клеточном инфильтрате у больных при этом уменьшилось с 11,4±0,4 до 6,6±0,4% (в десне здоровых людей эта цифра меньше: 3,5±0,64). Снижение этого показателя почти в 2 раза менее чем за месяц, свидетельствует о существенном улучшении функционального состояния тканей пародонта. При гистоморфологическом исследовании были выявлены типичные морфологические формы макрофагов фенотипа М2, что позволяет использовать такое исследование, в т.ч. и для оценки эффективности комплексного пародонтологического лечения [19]. Морфологический индекс макрофагов в основной группе изменился с 2,9 в начале исследования до 0,2 в конце периода наблюдения, т.е. в 14,5 раза. В группе сравнения, где методика не использовалась, в конце периода наблюдения морфологиче- ский индекс составил 0,6, что также подтверждает увеличение пропорции фенотипа М2 макрофагов, но в меньшей степени, чем в основной группе – только в 4,8 раза. Следует также указать, что выявленные морфологические различия в состоянии тканей пародонта в обеих группах больных полностью коррелировали с клинической картиной.

Заключение
Таким образом, полученные результаты позволяют рекомен- довать новую разработанную клиническую методику репро- граммирования макрофагов тканей пародонта in vivo в качестве дополнительного метода коррекции иммунного ответа в составе комплексного пародонтологического лечения хронического пародонтита. В отличие от известных клеточных биотехнологий репрограммирования макрофагов in vitro эта методика суще- ственно менее трудозатратна и реализуется непосредственно в присутствии больного.