МОДЕЛИРОВАНИЕ РИНОХИРУРГИЧЕСКИХ ВМЕШАТЕЛЬСТВ У КРЫС: ЭКСПРЕССИЯ БЕЛКА Р53 И ФОРМИРОВАНИЕ ТЕМНЫХ НЕЙРОНОВ В ГИППОКАМПЕ

Резюме. В исследовании оценивается корреляция между экспрессией белка p53 и количеством темных нейронов (ТН) в гиппокампе у крыс при экспериментальном моделировании септопластики. На 15 половозрелых крысах-самцах линии Wistar было проведено моделирование септопластики. Изучены гистологические срезы гиппокампа. В субполе СА1 количество p53-позитивных нейронов достоверно повысилось на 2-й, 4-й (p<0,001) и 6-й дни (p<0,05). В динамике пик роста экспрессии белка p53 в цитоплазме нейронов СА1 и СА2 пришелся на 2-4-е сутки после операции, а на 6-й день количество этих нейронов снизилось (p<0,001). В цитоплазме нейронов СА3 на всех сроках после хирургического вмешательства было отмечено увеличение экспрессии белка p53, по сравнению с контрольной группой. В пирамидном слое СА1 количество ТН на 6-й день снизилось (p<0,001). В СА2 через 2-е суток был отмечен минимум ТН, по сравнению с 4-м днем (p<0,001). В СА3 на 4-й день наблюдался пик ТН, по сравнению с остальными днями (p<0,001). Была обнаружена положительная сильная связь на всех сроках оценки и во всех субполях гиппокампа между ростом количества темных и p53-позитивных нейронов. Появление темных и p53-позитивных нейронов в гиппокампе у крыс после моделирования септопластики являетсятиповыми ответными реакциями нервной ткани на стресс. Базофилия цитоплазмы нейронов может являться следствием экспрессии белка p53, а именно, морфо-функциональных изменений нейрона. Предположительно белок p53 может запускать не только апоптоз поврежденных нейронов в гиппокампе, но и играть нейропротективную роль. Предстоящие исследования должны дифференцировать механизмы экспрессии белка p53.

Ключевые слова: септопластика, гиппокамп, темные нейроны, p53, апоптоз, нейрогенез.

Abstract. The study evaluates the dependence of p53 protein expression on the appearance of dark neurons (DN) in the hippocampus in rats during experimental modeling of septoplasty. Septoplasty simulation wascarried out on 15 sexually mature male Wistar rats. We studied histological sections of the hippocampus stained with Nissl toluidine blue and antibodies to the p53 protein. In the CA1 subfield, the number of p53-positive neurons significantly increased on the 2nd, 4th (p <0.001) and 6th days (p <0.05). In the dynamics, the peak of the growth of p53 protein expression in the cytoplasm of CA1 and CA2 neurons fell on the 2-4th day after the operation, and on the 6th day the number of these neurons decreased (p <0.001). In the cytoplasm of CA3 neurons at all periods after surgery, an increase in the expression of the p53 protein was noted as compared to the control group. In the CA1 pyramidal layer, the number of DN decreased on the 6th day (p <0.001). In CA2, after 2 days, a minimum of DN was noted, compared with the 4th day (p <0.001). In CA3, on the 4th day, there was a peak in DN, compared with the rest of the days (p <0.001). A positive strong association was found at all periods of assessment and in all subfields of the hippocampus between an increase in the number of dark and p53-positive neurons. The appearance of dark and p53-positive neurons in the hippocampal formation in rats after simulating septoplasty are typical responses of nervous tissue to stress. It is obvious that the expression of the p53 protein is associated with the basophilia of the cytoplasm of neurons, their morpho-functional state. Presumably, the p53 protein can trigger not only the activation of damaged neurons in the hippocampus, but also play a neuroprotective role. Upcoming studies should determine the role of the p53 protein in the further fate of damaged neurons in the pyramidal layer and differentiate the mechanisms of its expression.

Key words: septoplasty, hippocampus, dark neurons, p53, apoptosis, neurogenesis.

Белок р53 вместе с р63 и р73 составляют семейство транскрипционных факторов, которые регулируют фундаментальные процессы, включая пролиферацию, дифференцировку, старение и гибель клеток [1]. Эти белки были широко изучены в онкогенезе, но роль членов семейства в постмитотических нейронах до сих пор изучена недостаточно. Некоторые исследования предполагают, что это семейство может участвовать как в процессе развития нейронов, так и в нейродегенерации [2, 3]. Белок p53 является активатором транскрипции определенного набора генов-мишеней, ингибирующих клеточный цикл регуляторным фактором и эффектором клеточных ответов на повреждения, которые включают остановку клеточного цикла и апоптоз [4]. Вместе с тем, р53 является нейропротектором в модели таупатии in vivo. Поврежденные (тёмные) нейроны имеют специфические морфологические признаки: усохшая цитоплазма, сморщенное ядро с сегментированным хроматином и неровными границами, штопорообразный аксон [5, 6]. Считается, что в этих нейронах произошел запуск запрограммированной гибели клеток, в том числе и с участием белка p53 [7]. Существует мнение, что p53 участвует и в нейропротекции, в нейрогенезе. Точные механизмы апоптоза у ТН изучены не до конца. Однако не исключается, что темные нейроны при определенных условиях способны к восстановлению своего морфофункционального состояния [5].

Моделирование прямых и опосредованных стрессовых воздействий на головной мозг приводит к нарушению функционального состояния нейронов с последующими морфологическими изменениями [8]. Особое внимание при стрессе уделяется гиппокампу [9-11]. Нейроны его пирамидного слоя чувствительны к различным стрессовым факторам, в том числе и при хирургическом стрессе. Так было показано, что моделирование хирургических манипуляций в полости носа у крыс провоцирует экспрессию белка p53 в нейронах гиппокампа и появление темных нейронов [6, 12, 13]. При этом исследований, оценивающих параллелизм этих процессов при моделировании септопластики у крыс, не проводилось.

Цель исследования. В настоящем исследовании оценивается зависимость появления темных нейронов от экспрессии белка p53 в гиппокампе у крыс при экспериментальном моделировании септопластики.

Материал и методы. Хирургическое вмешательство. Работа была проведена на 20 половозрелых крысах-самцах линии Wistar массой 205,25±10,15 г. 5 крыс составили контрольную группу. За 10 минут до операции 15 крысам, которые составили экспериментальную группу, в целях общей анестезии внутрибрюшинно вводили раствор золетила 100 в дозировке 15 мг/кг. Моделирование септопластики проводили стандартным методом путем зигзагообразной скарификации слизистой оболочки полости носа (рис.1 А) [14].

Иммуногистохимическая и гистологическая оценка головного мозга. В экспериментальной группе крыс эвтаназию проводили на 2-е, 6-е и 14-е сутки после операции по 5 особей путем введения летальных доз золетила 100. Фиксацию головного мозга как в контрольной, так и в экспериментальной группах проводили до трепанации черепа путем перфузии через сердце физиологического раствора, а затем 10% раствора формалина в течении 5-10 мин. После трепанации черепа головной мозг фиксировали аппликацией 10% раствором формалина, после чего извлекали и заключали в парафиновые блоки. Получали 8 срезов головного мозга во фронтальной плоскости толщиной 4 мкм с каждой крысы. 4 среза окрашивали методами иммуногистохимии к белку р53 с докрашиванием гематоксилином Майера и 4 среза толуидиновым синим по Нисслю. Окрашенные стекла заключались в специальную полимерную ленту.

Изучали субполя гиппокампа СА1, СА2, СА3 и зубчатую извилину (DG) (рис.1 Б, В). В пирамидном слое субполей подсчитывали количество нейронов, у которых была положительная реакция с антителами к белку p53 в цитоплазме, а также количество темных нейронов (рис.2).Статистический анализ. Полученные данные подсчета клеток были представлены как среднее значение ± SE. Затем их сравнивали между данными подсчета нейронов в контрольной и экспериментальной группах с помощью t-теста с SPSS 21software, а также проводили корреляционный анализ между количеством ТН и количеством p53-позитивных нейронов в экспериментальной группе в программе Microsoft Exel.

Результаты исследования. P53-позитивные нейроны. Согласно критерию Манн-Уитни, в субполе гиппокампа СА1 количество p53-позитивных нейронов достоверно повысилось на 2-й, 4-й (p<0,001) и 6-й дни (p<0,05) после проведения моделирования септопластики, по сравнению с контрольной группой. В динамике пик роста экспрессии белка p53 в цитоплазме пирамидного слоя СА1 и СА2 гиппокампа пришелся на 2-4-е сутки после операции, а на 6-й день количество этих нейронов значимо снизилось (p<0,001).

При этом в субполе СА2 на 6-й день по p53-позитивным нейронам экспериментальная группа не отличалась от контрольной (рис.3а). В пирамидном слое субполя СА3 на всех сроках после хирургического вмешательства была отмечена повышенная стойкая экспрессия в цитоплазме нейронов белка p53, по сравнению с контрольной группой (p<0,001).

В зубчатой извилине у крыс экспериментальной группы, по сравнению с интактными крысами, количество p53-позитивных нейронов было значимо выше на всех сроках оценки. При этом пик

численности этих клеток пришелся на 4-й день, по сравнению с остальными постоперационными сроками (p<0,001) (рис.3а)

Темные нейроны. По количеству ТН в пирамидном слое гиппокампа в экспериментальной и контрольной группах распределение данных было не Гаусово. Согласно критерию Манн-Уитни, пирамидном слое субполя СА1 количество темных нейронов на 2-й и 4-й постоперационный день достоверно не отличалось от контрольной группы, но на 6-й день после моделирования септопластики было отмечено снижение их количества (p<0,001). В субполе СА2 экспериментальной группы через 2-е суток после операции было отмечено минимальное количество темных нейронов, по сравнению с 4-м

Рис. 3. Динамика изменения количества p53-позитивных нейронов (p53) (а) и темных нейронов (б) при моделировании септопластики. Примечание: * – достоверные различия между данными контрольной группы и сроками после операции (p<0,001); ^˅ – достоверные различия между данными контрольной группы и сроками после операции (p<0,05); ^† – достоверные различия между сроками после операции внутри экспериментальной группы (p<0,001); ^‡ – достоверные различия между сроками после операции внутри экспериментальной группы (p<0,05).

Корреляция между p53-позитивными и темными нейронами. При сопоставлении количества нейронов, в которых белок p53 экспрессировался в цитоплазме, и количества темных нейронов, была обнаружена положительная сильная связь на всех сроках оценки и во всех субполях гиппокампа (табл.1). Самый низкий R² был обнаружен при оценке субполя СА2 на 4-й день после операции.

Неизбежным фактором, влияющим на морфо-функциональное состояние организма, является стресс [8, 15-17]. Апоптоз нейронов возникает при различных физиологических и

патологических процессах и является генетически контролируемой формой гибели клеток [18].

Формирование темных нейронов в субполях СА1 и СА3 гиппокампа крыс в настоящем исследовании, по-видимому, является типовой реакцией на стресс, который в данном случае спровоцирован воспалительными реакциями. Так, ранее было показано, что при моделировании острого перитонита у свиней и крыс в субполях CA1 и CA2 также наблюдается образование темных нейронов [19]. Это связывают с активацией механизмов апоптоза, так как рост количества ТН коррелирует с положительными TUNEL-нейронами [17]. Другие исследования также подтверждают, что сморщивание нейрона и его базофилия могут служить надежными признаками начинающейся его дегенерации [19, 20]

Синтез белка p53 активируется клеточным стрессом и повреждением ДНК. В зависимости от тяжести стресса и конкретного типа клеток он может способствовать адаптивным ответам на стресс, запускать остановку клеточного цикла или апоптоз [21]. Исследования клеточных культур установили сильную корреляцию между экспрессией p53 и эксайтотоксической гибелью нейронов, вызванной глутаматом, N-метил-D-аспартатом (NMDA), агонистом рецептора NMDA хинолиновой кислотой и каиновой кислотой [22, 23].

Кроме широко изученной роли p53 как регулятора запуска апоптоза, была продемонстрирована и его нейропротекторная роль [24]. Так, результаты P. Merlo et al. предполагают, что синапс является важной мишенью р53 в нейропротекции при некоторых нейродегенеративных заболеваниях. P53 контролирует транскрипцию генов, кодирующих ключевые белки экзоцитоза синаптических пузырьков и рециркуляции. Это показывает новый аспект ответа р53 на клеточное повреждение и предполагает защитный молекулярный механизм против одного из первых проявлений нейродегенерации. Предполагается, что вместо того, чтобы способствовать гибели клеток, р53 может быть частью древней и консервативной защитной реакцией на стресс, которая необходима для защиты нейронов и поддержания нейронных систем, включая синаптическую функцию [3].

Было показано, что р53 необходим для смягчения нарушений дифференцировки и роста нейронов после их облучения и, таким образом, может играть существенную роль в регулировании поздних эффектов в мозге после проведения радиотерапии [25]. Показано, что p53 регулирует некротическую гибель и аутофагическую активность нейронов [26].

В предыдущих исследованиях нами было продемонстрировано, что при моделировании септопластики в гиппокампе у крыс встречаются нейроны, в которых белок p53 появляется как исключительно в цитоплазме, так и в ядре [6, 27, 28]. В последнем случае нейроны носили характерные морфологические признаки дегенерации – склеивание хроматина, нечеткость границ ядра, а в ряде случаев – распад клетки [6]. Можно предположить, что p53 может и не носить исключительно роль регулятора апоптоза.

Ранее также было показано, что темные нейроны могут восстанавливать свое морфо-функциональное состояние за счет увеличения цистерн гранулярной эндоплазматической сети, переходом этого процесса на астроцитарные отростки и, как следствие, с последующим снижением степени уплотнения клетки [5]. Кроме этого, ТН могут иметь признаки конечного некротического распада клетки независимо от причины гибели нейрона, в том числе и от апоптоза [7]. При этом маркеры апоптоза могут появляться и отсроченно [29], особенно после нейрональных повреждений, индуцированных кортикотропин-релизинг гормоном [30], что в дальнейшей перспективе может привести к различным нейробиологическим последствиям – нарушению памяти, поведенческих реакций и др. [31]. Ранее нами было показано, что моделирование септопластики у крыс провоцирует повышение тонуса симпатической нервной системы и концентрации кортикостерона в плазме крови в течение первых 4-5 дней после операции [32]. Кроме того, в предыдущих исследованиях нами были получены результаты, демонстрирующие, что при данном виде хирургических вмешательств изменяются поведенческие реакции и развивается тревожное состояние у крыс [14], что можно связать не только с развитием общих воспалительных реакций, но и с сенсорной депривацией периферического отдела обонятельного анализатора [6, 32]. Обнаруженные в настоящем исследовании высокие коэффициенты детерминации подтверждают теорию того, что появление темных нейронов в гиппокампе и зубчатой извилине тесно связано с экспрессией белка p53 при хирургическом стрессе, спровоцированном моделированием септопластики у крыс.

Заключение. Появление темных и p53-позитивных нейронов в гиппокампальной формации у крыс после моделирования септопластики является типовыми ответными реакциями нервной ткани на стресс. Очевидно, что экспрессия белка p53 связана с базофилией цитоплазмы нейронов, их морфо-функциональным состоянием.

Конфликт интересов: Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Скачать статью в PDF