Изменения структуры геномной ДНК мононуклеарных клеток крови человека в острейшем периоде ишемического инсульта

Материал и методы. Объектом исследования выступила периферическая венозная кровь здоровых лю- дей и пациентов с ИИ в первые сутки заболевания, полученная при наличии информированного согласия. Степень нарушений функций ЦНС оценивались по критериям шкалы NIHSS (National Institutes of Health Stroke Scale – NIH Stroke Scale) с сопоставлением размера очага острой ишемии головного мозга, который реги- стрировался с помощью мультиспиральной компьютерной томографии. Мононуклеарные клетки получали из свежей периферической крови, из которых выделяли тотальную ДНК. Фурье ИК-спектры препаратов ДНК регистрировали на спектрометре IRPrestige-21 SHIMADZU(Япония) в диапазоне 400– 4000 см-1 . Результаты. С помощью метода Фурье ИК-спектроскопии показано, что у больных ИИ наблюдаются из- менения в ИК-спектрах геномных ДНК при частотах, обусловленных валентными колебаниями первичных аминов (3400 см-1), вторичных аминов и гидроксилов, вовлеченных в водородную связь (3100 см-1), СН2-групп сахаро-фосфатов (2900 см-1), колебаниями вибрационных связей между азотистыми основаниями и сахарами (1400 см-1). При тяжелом ИИ выраженность выявленных изменений ИК-спектров ДНК была максимальной. Заключение. У больных ИИ наблюдаются значительные изменения в ИК-спектрах геномных ДНК, которые свидетельствуют о повреждении геномных ДНК, в частности транскрипционной, определяющей формиро- вание патологического фенотипа клеток, как вероятного механизма изменения активности генетических процессов,. Характер и интенсивность этих изменений зависят от тяжести заболевания, что определяет возможность использования их в качестве дополнительных биомаркеров тяжести и прогноза ИИ. Ключевые слова: ишемический инсульт, окислительный стресс, геномная ДНК, мононуклеарные клетки, ИК-спектроскопия Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Финансирование. Работа выполнена без спонсорской поддержки.

Objective. Evaluation of changes in the spectral analysis of the genomic DNA of mononuclear cells in patients with varying degrees of severity of central nervous system disorders in ischemic stroke. Material and methods. The object of the study was peripheral venous blood of healthy people and patients with ischemic stroke. We took the blood samples on the first day of the disease with patients’ informed consents and evaluated the degree of central nervous system dysfunction according to the NIHSS scale criteria (National Institutes of Health Stroke Scale – NIH Stroke Scale) with a comparison of the acute cerebral ischemia focus size recorded by multispiral computed tomography (MSCT). Mononuclear cells isolation from fresh peripheral blood. They were the source for DNA sample. We recorded Fourier IR spectra of DNA samples with the IRPrestige-21 SHIMADZU spectrometer (Japan) in the range of 400–4000 cm-1 . Results. We used the Fourier method of IR spectroscopy. It showed that patients with ischemic stroke have changes in the IR spectra of genomic DNA at frequencies caused by valence fluctuations of primary amines (3400 cm-1), secondary amines and involved in hydrogen bond hydroxyls (3100 cm-1), CH2 groups of sugar-phosphates (2900 cm-1), fluctuations of vibrational bonds between nitrogenous bases and sugars (1400 cm-1). In severe ischemic stroke, the detected changes in the IR spectra of DNA were maximum. Conclusion. In patients with ischemic stroke, the IR spectra of genomic DNA include significant changes, which indicate damage to genomic DNA as a possible mechanism of changes in the activity of genetic processes, in particular transcription, which determines the formation of a pathological phenotype of cells. The nature and intensity of these changes depend on the severity of the disease, which determines the possibility of using them as additional biomarkers of the severity and prognosis of ischemic stroke. Key words: ischemic stroke, oxidative stress, genomic DNA, mononuclear cells, IR spectroscopy Conflicts of interest. The authors have no conflicts of interest to declare. Funding. There was no funding for this study

Введение. Важнейшим патогенетическим механизмом ишемического инсульта (ИИ), особенно в острейший период (первые 5 суток после начала заболевания), выступает окислительный стресс [1], последствия которого определяются способностью клеток и тканей организма устранять интермедиаты свободноради- кальных реакций и восстанавливать вызванные повреждения биомолекул, включая липиды, белки и нуклеиновые кислоты [2–4]. Цитотоксические эффекты окислительного стресса опос- редованы развивающимися мембранодеструктивными процес- сами, повреждениями ДНК, запускающими механизмы гибели клеток и формирующими тканевые и органные дисфункции, обусловливающие тяжесть заболевания [5]. Окислительные повреждения в ДНК включают в себя депу- ринизацию/дипиримидизацию, одноцепочечные и реже двуце- почечные разрывы сахаро-фосфатного остова ДНК, сшивки ДНК-ДНК, ДНК-белок, образование циклических ДНК-аддуктов и некоторые другие, устраняемые при участии 8-оксогуанин- ДНК-гликозилазы и других ферментов эксцизионной репарации оснований и нуклеотидов [6]. Неустраненные до последующей репликации повреждения приводят к появлению мутаций и геномному мозаицизму соматических клеток [7, 8], частота возникновения которых зависит структурных особенностей ДНК [9, 10]. Накопление повреждений ведет к изменению пространствен- ной структуры и функциональной активности геномной ДНК, что может влиять на запуск компенсаторно-приспособительных реакций в ответ на патологические процессы, протекающие в острейшем периоде ИИ, и иметь отдаленные последствия для нервных клеток головного мозга. В связи с этим исследования модификаций геномных ДНК клеток крови у больных ИИ представляют научный и практи- ческий интерес. Цель исследования. Оценка изменения спектрального ана- лиза геномной ДНК мононуклеарных клеток у пациентов с нарушениями функций центральной нервной системы (ЦНС) разной степени выраженности при ишемическом инсульте (ИИ). В работе применен метод Фурье ИК-спектрометрии, перспектив- ный метод исследования структурных изменений нуклеиновых кислот (образование и разрыв водородных и других связей, изменения конформации и конфигурации). Материал и методы Клиническое исследование проведено на базе ГБУЗ РМ «Мордовской республиканской центральной клинической больницы» (Саранск). Все пациенты с ИИ при поступлении были обследованы согласно действующим стандартам оказания медицинской помощи пациентам с острыми нарушениями моз- гового кровообращения. Протокол клинического исследования составлен в соответствии с действующими этическими стандар- тами и одобрен локальным этическим комитетом медицинского института ФГБОУ ВО МГУ им. Н.П. Огарева. Объектом исследова- ния выступила периферическая венозная кровь здоровых людей и пациентов с ИИ, полученная в первые сутки заболевания при наличии информированного согласия. Степень нарушений функций ЦНС оценивали по критериям шкалы NIHSS (National Institutes of Health Stroke Scale – NIH Stroke Scale) с сопоставлением размера очага острой ишемии головного мозга, который регистрировали с помощью муль тиспиральной компьютерной томографии [11]. Обследуемые были разделены на группы: I – контрольная (n=20), включены здоровые пациенты и без факторов риска по ИИ, II – пациенты с легкой степенью нарушений функций ЦНС по шкале NIHSS от 1 до 4 баллов (n=20), III – пациенты со среднетяжелой степенью нарушений функций ЦНС, очаговый неврологический дефицит соответствовал по шкале NIHSS 5–14 баллам, IV – пациенты с тяжелой степенью нарушений функции ЦНС, неврологический дефицит составлял по шкале NIHSS 15–20 баллов. Мононуклеарные клетки выделяли из свежей периферической крови, стабилизированной K 3 ЭДТА с использованием фиколла плотностью 1,077 г/см3 , из которых выделяли тотальную ДНК по известной методике [12]. Клетки лизировали 10% раство- ром додецилсульфата натрия (SDS) в присутствии протеина- зы К в конечной концентрации 0,1 мг/мл и инкубировали при 55 оС в течение 2 часов. Для высаливания белков применяли 5,3 М раствор NaCl. ДНК осаждали изопропанолом на холоде. Препарат ДНК промывали 70% этанолом, добиваясь высокой степени очистки (А260/А280≥1,8). Препарат ДНК получали с помощью лиофильной сушки FreeZonePlus, перемешивали с КВr и формировали таблетки. Фурье ИК-спектры препаратов ДНК регистрировали на спектроме- тре IRPrestige-21 SHIMADZU(Япония) в диапазоне 400–4000 см-1 . Изменение интенсивности поглощения характерных полос рас- считывали по отношению к поглощению при частоте 4000 см-1 . Данные статистически обрабатывали методом вариацион- ной статистики с использованием t-критерия Стьюдента для несвязанных совокупностей. Для корректного использования t-критерия Стьюдента проводили проверку второго ограничения (равенства дисперсий тестом Левена). Результаты Патологический фенотип больных ИИ характеризовался в зависимости от тяжести заболевания повышенным риском свертываемости крови (снижение активированного частичного тромбопластинового времени – АЧТВ), нарушением кислород- транспортной способности крови, гиперхолестеринемией и нарушением обмена триацилглицеролов, липопротеидов низкой плотности. Концентрации перекисей в плазме крови больных ИИ были выше относительно контроля в 1,5 и 1,66 раза (p<0,05) при легком (II группа) и тяжелом (IV группа) течении соответст- венно. Приведенные выше данные свидетельствуют о наличии в организме больных ИИ предпосылок для модификации и повреждения геномных ДНК. В спектрах поглощения контрольных и опытных образцов ДНК присутствуют полосы в диапазоне частот 2900–3400 см-1 , 2960–2850 см-1, 1500–1250 см-1 и 1150–750 см-1 (рис 1). Данные полосы обусловлены колебаниями связей в NH2-, NH-, OH-, СН2-группах, а также связей между азотистыми основаниями и сахарами (область колебаний функциональных групп в составе сахарофосфатного остова ДНК) и симметричными колебаниями связей в фосфатных группах -РО2 соответственно [13]. В то же время ИК-спектры геномных ДНК контрольных и опытных образ- цов отличаются интенсивностью поглощения некоторых полос. Как видно из ИК-спектров наиболее заметные изменения наблюдаются в диапазоне частот 2900–3600 см-1, 2960–2850 и 1500–1250 см-1. Известно, что у большинства биоорганических веществ (единичная цепь спирали ДНК, белков и т.д.) в области 2900–3600 см-1 находятся полосы валентных колебаний гидрок- сила (-ОН), первичных и вторичных аминогрупп (-NH2, -NH-). Исходя из вышеизложенного следует, что в ИК-спектрах исследованных образцов ДНК полоса с максимумом 3400 см-1 обусловлена валентными колебаниями первичных ами- нов, а 3100 см-1 обусловлена колебаниями вторичных аминов и гидроксилов, вовлеченных в водородную связь между ком- плементарными парами азотистых оснований. Была выявлена закономерность максимального повыше- ния интенсивности поглощения ряда характерных полос при тяжелой степени выраженности патологического процесса. Особенно резкое повышение интенсивности полос поглощения наблюдалась при частотах 3400 см-1, обусловленных валентными колебаниями первичных аминов; 3100 см-1, характерных для вторичных аминов и гидроксилов, вовлеченных в водородную связь; 2900 см-1 -, характерных для СН2-групп сахаро-фосфатов, и 1400 см-1, обусловленных колебаниями вибрационных связей между азотистыми основаниями и сахарами. Величины отношения интенсивности поглощения первичных и вторичных аминов КNH2/NH представлены на рис. 2. Известно, что вклад первичных и вторичных аминов азотистых оснований в образование водородных связей и их количество различаются: аденин-тимин связаны между собой двумя водо- родными связями, гуанин-цитозин – тремя водородными свя- зями, соответственно, водородные связи с участием первичных аминов (N-H ··· N) между гуанином и цитозином намного сильнее по сравнению с N-H ··· N связью между тимином и аденином [14]. У пациентов с легкой степенью отмечается незначитель- ное уменьшение величины данного коэффициента, а при тяже- лой – значение коэффициента снижается в среднем в 1,5 раза. Снижение величины коэффициента (К) ниже 1 указывает на ослабление водородных связей с участием первичных аминов и нарушении структуры ДНК. Снижение коэффициента в 1,4 раза и ниже указывает на выраженные структурные перестройки в ДНК (ослабление водородных связей между азотистыми основаниями, снижение стабильности или пространственной устойчивости) связей сахаров и оснований, что характерно для тяжелого ИИ. Особого внимания заслуживают изменения в ИК-спектре ДНК больных в областях, свидетельствующих о перестройках в сахарофосфатном остове ДНК (рис. 3), связанных, в частности с изменением эффективности ионных взаимодействий между функциональными группами отдельных фрагментов молекулы, за счет которых поддерживается определенная конформация ДНК. Известно, что структурные изменения геномной ДНК, сопряженные с перестройками наружного каркаса «скелета», могут приводить к снижению стабильности связей сахар-осно- KCH2 КNS вание ДНК, их «разбалтыванию» [15]. В нашем исследовании выявлено резкое увеличение интенсивности поглощения в участ- ке ИК-спектров, ответственных за колебания связей между азотистыми основаниями и дезоксирибозой. Такие изменения в спектре указывают на смещение взаимной ориентации фосфат- ных групп ДНК, что является следствием локального раскручи- вания двойной спирали, перераспределения водородных связей между азотистыми основаниями, появления в ней изгибов, приводящих в совокупности к изменению пространственной структуры ДНК. Выявленные изменениями в ИК-спектрах геномных ДНК при ИИ свидетельствуют также об ослаблении играющих важную роль в стабилизации вторичной структуры ДНК стэкинг-вза- имодействий, стабильность которых в значительной степени зависит от связей между основаниями и сахарами. Вследствие этого обеспечивается доступ воды и других низкомолекулярных водорастворимых молекул, включая угольную кислоту, внутрь двойной спирали, где они конкурируют с полярными группа- ми оснований за образование водородных связей, приводя к нарушению водородных связей между комплементарными парами оснований с участием первичных и вторичных аминов, уменьшению эффективности стэкинг-взаимодействия между азотистыми основаниями, дестабилизации двойной спирали и облегчению расхождение цепей ДНК. Подобный эффект плавления двуспиральной ДНК выявлен нами в клетках крови у пациентов со среднетяжелой и тяжелой степенями выраженности поражения ЦНС при ИИ. Окончательно неясным остается влияние данного эффекта на фенотип клеток и связь этого с нарушением генной экспрессии определенного пула клеток. Данные вопросы представляют перспективу развития темы. На данном этапе, можно констатировать, что в анализиру- емых изолированных препаратах геномной ДНК клеток при ИИ выявлены следующие эффекты: ослабление водородных связей между комплементарными парами азотистых оснований двуспиральной ДНК, а также стабильности (пространственной устойчивости) связей сахаров и оснований. Также однознач- но нельзя сделать заключения о том, какой процесс является первичным. Заключение У больных ИИ наблюдаются значительные изменения в ИК-спектрах геномных ДНК, которые свидетельствуют о повре- ждении геномных ДНК, приводящих, в частности, к изменению транскрипционной активности, определяющей формирование патологического фенотипа клеток, как вероятного механизма изменения активности генетических процессов. Характер и интенсивность этих изменений зависят от тяжести заболева- ния, что определяет возможность использования их в качестве дополнительных биомаркеров тяжести и прогноза ИИ