Изменения морфофункционального состояния сальных желез у крыс после аутотрансплантации жира у крыс на отдаленных сроках

От вида обработки жировой ткани перед ее трансплантацией зависят во многом результаты качества пере- саженного жира. Липофилинг необходим для ликвидации дефицита объема тканей, существует проблема его приживаемости в реципиентном месте. В клинических и в экспериментальных работах недостаточно внимания уделяется изучению реакций кожи и ее придатков (волосяных фолликулов, сальных желез и др.) при аутотрансплантации жира после различных методов его обработки. Работ, направленных на изучение активности такого маркера пролиферации, как Ki-67, в сальных железах при аутотрансплантации жировой ткани, нет вовсе.
Цель исследования: оценить изменения морфофункционального состояния сальных желез и экспрессию Ki-67 как маркера пролиферации в сальных железах у крыс после аутотрансплантации жира на отдаленных сроках.
Материал и методы. Исследована экспрессия бека Ki-67 в сальных железах после аутотрансплантации жира у крыс через 30, 90 и 180 дней. Было применено 3 вида жировых аутотрансплантатов: со`лидный графт, измельченный скальпелем графт и гомогенизированный жир в шприце Luer Lock.
Результаты. Аутотрансплантация жира стимулирует экспрессию белка Ki-67 клетками концевых отделах сальных желез, при чем через месяц этот показатель выше в группах со`лидного графта и гомогенизиро- ванного жира, а через 3 и 6 месяцев – в группе измельченных скальпелем жировых графтов. Чем выше экспрессия белка Ki-67 клетками сальных желез, тем больше их площадь, что свидетельствует о различном действии некоторых методов предоперационной обработки жировых аутотрансплантантов на их морфофунк- циональную активность в месте трансплантации жира. В большей степени подобное действие оказывает трансплантация мелких жировых графтов на сроках 3 и 6 месяцев в реципиентной области.
Заключение. Побочный эффект аутотрансплантации гомогенизированного жира в гиподерму на поздних сроках может оказывать терапевтическое действие для снижения пролиферативной активности сальных желез.
Ключевые слова: трансплантация жира, Ki-67, липофилинг, пролиферация, сальные железы
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Финансирование. Работа выполнена без спонсорской поддержки.

The quality of transplanted fat depends largely on the type of fat tissue processing before its transplantation. Lipofilling is necessary to eliminate the deficit of tissue volume; there is a problem of its engraftment in the recipient site. Insufficient attention is paid in clinical and experimental studies to the study of the reactions of the skin and its appendages (hair follicles, sebaceous glands, etc.) during fat autotransplantation after various methods of its processing. There are no works aimed at studying the activity of such a proliferation marker as Ki-67 in the sebaceous glands during fat autotransplantation.
Aims: to evaluate changes in the morphofunctional state of the sebaceous glands and the expression of Ki-67 as a proliferation marker in the sebaceous glands in rats after fat autotransplantation in rats at late stages.
Material and methods. The expression of the Ki-67 bek in the sebaceous glands after fat autotransplantation in rats was studied after 30, 90 and 180 days. Three types of fat autografts were used: solid graft, scalpel-cut graft, and homogenized fat in a Luer Lock syringe. Results. Fat autografting stimulates the expression of Ki-67 protein by cells in the terminal sections of the sebaceous glands, with this indicator being higher in the solid graft and homogenized fat groups after a month, and in the scalpelcut fat graft group after 3 and 6 months. The higher the expression of Ki-67 protein by sebaceous gland cells, the larger their area, indicating different effects of some methods of preoperative treatment of fat autografts on their morphofunctional activity at the site of fat transplantation. Transplantation of small fat grafts at 3 and 6 months in the recipient area has a greater similar effect.
Conclusion. The side effect of homogenized fat autografting into the hypodermis at late stages may have a therapeutic effect in reducing the proliferative activity of the sebaceous glands.
Key words: fat transplantation, Ki-67, fat grafting, proliferation, sebaceous glands.
Conflicts of interest. The authors have no conflicts of interest to declare. Funding. There was no funding for this study

Введение В 2021 г. мета-анализ статей, посвященных пересадке жира, показал, что сохранение жирового трансплантата варьирова- лось от 26 до 83% [1]. От вида обработки жировой ткани перед ее трансплантацией зависят во многом результаты качества пересаженного жира. Существуют разные подходы к его пре- доперационной подготовке [2, 3]. Липофилинг необходим для для ликвидации дефицита объема тканей [4]. Кроме того, су- ществует проблема его приживаемости в реципиентном месте [5], в т.ч. и трансплантатов больших объемов [6]. В недавних экспериментальных исследованиях на крысах было показа- но, что различные техники обработки жировой ткани перед ее трансплантацией способствуют формированию различной гистологической реакции в реципиентном месте со стороны окружающих трансплантат тканей, в частности сальных желез [7]. Некоторые авторы полагают, что с онкологической точки зрения липофилинг не совсем безопасен [8, 9]. В целом, как в клинических, так и в экспериментальных рабо- тах недостаточно внимания уделяется изучению реакций кожи и ее придатков (волосяных фолликулов, сальных желез и др.) при аутотрансплантации жира после различных методов его обработки [7]. Так, не в полной мере дана иммуногистохими- ческая оценка пролиферативной активности сальных желез после различных моделей липофилинга. Работ, направленных на изучение активности такого маркера пролиферации, как Ki-67, в сальных железах при аутотрансплантации жировой ткани, нет вовсе. Цель исследования: оценить изменения морфофункциональ- ного состояния сальных желез и экспрессию Ki-67 как маркера пролиферации в сальных железах у крыс после аутотрансплан- тации жира на отдаленных сроках. Материал и методы Исследование было проведено на 65 половозрелых крысах- самцах линии Wistar. Контроль-негативную группу интактных животных (1-я группа) составили 5 крыс, которым не проводилось никаких манипуляций. Во 2-й группе (контроль-позитивная) 15 крысам иглой 25G (D=0,5 мм) в участок кожи на холке площадью 1 см2 внутрикожно 6-кратно вводили 0,05 мл 0,9% раствор хло- рида натрия. В 3-й группе 15 крысам вводили аутотрансплантат цельной необработанной собственной жировой ткани размером 2х4х3 мм (1,2±0,5 мг) в область холки через разрез длиной 5 мм. В 4-й группе 15 крысам проводилась трансплантация пред- варительно измельченной скальпелем собственной жировой ткани 1х2х1 мм (1,33±0,47 мг). Крысам данной группы в область холки через разрез 0,5 см вводили предварительно измельчен- ную скальпелем массу жировую ткани. В 5-й группе 15 крысам через иглу 20G (D=1 мм) в области холки внутрикожно вводили препарат собственной жировой ткани после предварительной ее обработки в шприце Луер Лок (2 мл) с последовательной сменой насадок с диаметром отверстий от 2,4 до 0,2 мм. Критерием готовности материала была его способность проходить через иглу шприца диаметром 0,6 мм. Объем одной инъекции составлял 0,05 мл посредством 6 инъекций на площадь 1 см2. Жировую ткань у всех крыс извлекали из паховой области (рис. 1) и промывали охлажденным 0,9% раствором хлорида натрия, после чего обра- батывали одним из указанных методов. Эксперименты выполнены в соответствии с требованиями Директивы 2010/63/EU. Исследование одобрено локальным Комитетом по Этике медицинского института РУДН, протокол №02-24 от 20.02.2023. Всем крысам 2–5-й групп манипуляции проводили под общей анестезией при помощи изофлуранового наркоза (6%) в экс- икаторе. После этого крыс проверяли на стандартные защитные рефлексы. Затем уменьшали подачу наркоза в испарителе до 0,6–1,0%. После чего животные помещались на операцион- ном столе и им надевали наркозную маску. После окончания процедур выключали испаритель и снимали наркозную маску. Эвтаназию крысам 2–5-й групп проводили через 30, 90 и 180 дней после проведения эесперимента при помощи внутрибрю- шинного введения токсичных доз раствора Золетила 100. После этого проводили вырезку тканей в области холки. Ткани после проведения их забора помещали в 10% раствор забуференного формалина и фиксировали в течение 1 недели. Ткани заливали парафином и готовили парафиновые блоки. Толщина всех срезов составляла 4 микрона. Срезы окрашивали моноклональ- ными кроличьими антителами антителами к белку Ki-67 (клон GM0010, Россия). Оценивали площадь сальных желез (ПСЖ) и долю Ki-67-позитивных клеток в них. Препараты сканировали на микроскопе KFBIO 400 (Konfoong Biotech International Co., Ltd., КНР). Сканированные срезы анализировали при помощи программного обеспечения Aperio ImageScope v12.2.2.5015 (Leica Microsystems, Франция). Данные обрабатывали в программном обеспечении Microsoft Exel, MATLAB, Statistica 12.6, JASP 0.14.0.0. При сопоставлении данных группы на различных сроках после введения препаратов применялся критерий Вилкоксона. При сравнении данных экс- периментальных групп между собой и с данными контрольных групп применяли критерии Краскела–Уоллиса или Манна–Уитни. Для каждого сравнения по результатам статистического анализа определяли свой уровень значимости (р< от 0,001 до 0,05). Результаты В сальных железах число клеток с экспрессией белка Ki-67 составляло в 1-й группе 5,67±1,33%, а во 2-й группе на 30-й день – 6,27±1,08%, на 90-й день – 5,88±1,05%, на 180-й день – 6,14±1,11%. При этом между собой 1-я и 2-я группы значимо не различались по этому показателю (рис. 2). ПСЖ между 1-й (5084±237 мкм2) и 2-й (контроль-позитивной) группами (1, 3 и 6 мес. – 4982±192 мкм2, 5004±213 и 4824±226 мкм2, соответст- венно) не отличалась. ПСЖ в 3-й группе через 30 дней после проведения экспе- римента составила 4899±235 мкм2 и на следующих сроках ее размер уменьшался. Так, через 3 месяца ПСЖ была 3622±384 мкм2, а через 180 дней – 3441±283 мкм2. В сальных железах число клеток с экспрессией белка Ki-67 на 30-й постопераци- онный день составило 11,33±1,24%, на 90-й день – 8,16±0,94%, а на 180-й день – 6,33±0,55 мкм2 (рис. 3). В группе животных, которым была проведена имплантация измельченного скальпелем жирового графта, через месяц после хирургического вмешательства ПСЖ составила 5709±247 мкм2. Через 90 дней этот показатель в 4-й группе снизился и соста- вил 3145±191 мкм2, а через 6 месяцев после трансплантации аутожира ПСЖ была 3025±177 мкм2. Доля Ki-67-позитивных клеток в сальных железах у животных 4-й группы через 30 дней после операции составила 9,67±0,42%. Через 2 месяца (90-й постоперационный день) их число возросло (10,16±0,58%), а через полгода после операции снизилось до 7,66±0,86% (рис. 4). ПСЖ в группе животных, которым вводили гомогенизирован- ный жир, через 30 дней была 5405±132 мкм2. В последующие временные точки ее анализа ПСЖ снижалась. Через 90 дней площадь сальных желез составила 3608±233 мкм2, а через 180 дней она была 3147±192%. Экспрессия белка Ki-67 в 5-й группе через 30 дней была обнаружена в 12,15±0,87% клеток сальных желез. Через 3 месяца их число снизилось и составило 7,87±1,07%, а через 6 месяцев – 5,13±0,88% (рис. 5 в, г). Самая низкая экспрессия Ki-67 ПСЖ наблюдалась в 4-й груп- пе (группа измельченного жира) по сравнению с остальными экспериментальными группами. Обсуждение Данное исследование является первым, в котором описана экспрессия белка Ki-67 в сальных железах в зависимости от вида обработки пересаженного аутожира у крыс. Введение аутожира, обработанного в шприце с насадкой Луэра, приводит к улучшению качества рубца, снижается его пигментация и он становится менее ригидным. Предполагается, что пересадка нефильтрованного наножира, по-видимому, является многообещающим и эффективным терапевтиче- ским подходом к лечению послеожоговых рубцов в области головы и шеи, что было продемонстрировано значительным улучшением качества рубца [10, 11]. Раны с оголенной костью в эксперименте у крыс, обработанные отрицательным давле- нием (ОД) в сочетании с пересадкой жира, имели высокую пролиферацию клеток, неоангиогенез и значительное созре- вание функционирующих кровеносных сосудов. В этой группе крыс был выявлен ускоренный рост грануляционной ткани над оголенной костью по сравнению с ранами, обработанными лишь ОД или пенной повязкой. При трансплантации жира без дополнительных воздействий над оголенной костью возник некроз пересаженных тканей. Экспрессия маркеров анги- огенеза (VEGF и b-FGF) и факторов экспрессии адипоцитов (FABP-4) была повышена в ранах, обработанных ОД в сочетании с пересадкой жира. При сравнении с результатами настоящего исследования, очевидно, что для высокой выживаемости аутотрансплантата и его хорошей васкулярицации необходимо достаточное кро- воснабжение, что в дальнейшем будет способствовать выс- вобождению факторов дифференцировки тканей клетками стромально-васкулярной фракции трансплантата [12]. Эффект стромальных клеток жировой ткани подтверждается в исследо- вании липофилинга у молодых и старых мышей. Сохранность аутотрансплантата была выше у молодых особей с простым липофилингом и у пожилых особей, которым вводили жир, обогащенный стромальными клетками жировой ткани. Число Ki-67-позитвных клеток в таких группах было выше [1]. Эти результаты подтверждают то, что положительное действие на пролиферацию клеток в сальных железах в экспериментальных группах настоящего исследования оказывают, по-видимому, стромальные клетки жировой ткани аутотрансплантата [9]. Трансплантация жира ведет к развитию стрессовых реакций, которые, как и гипоксия, могут запустить процесс апоптоза клеток на ранних стадиях после операции [13–17]. В исследовании X. Jin и соавт. оценивалось воздействие аутотрансплантации жира, обогащенного стволовыми клетками жировой ткани (СТЖТ), на пролиферации опухоли в реципиент- ном месте. Было показано, что масса жировой ткани опухоли была значительно выше в группе с высоким СТЖТ, чем в группах сравнения (p<0,05). Однако масса самой опухоли существенно не отличалась между группами. Кроме того, выживаемость аутотрансплантата жира была значительно выше в группе с высоким содержанием СТЖТ, чем в контрольной группе и в группе с низким уровнем СТЖТ (p<0,05). Не было выявлено значимых отличий между группами в процентном соотношении клеток, положительных по Ki-67, что позволило авторам предположить, что пролиферация опухоли существенно не отличалась между группами и аутотранспланта- ция жировой ткани с СКЖТ не оказывает онкопролиферативного влияния [9]. В клинических исследованиях на 59 пациентках с раком молочной железы было показано, что через 38–42 месяца после проведения липофилинга наблюдался более высокий риск у пациентов с интраэпителиальной неоплазией, где маркером пролиферации выступал Ki-67 [18]. Однако авторы четко не указывают на рецидив онкологического процесса и высказывают мнение, что исследование должно проводиться на большей выборке пациентов. В настоящем исследовании маркер Ki-67 является маркером нормальной, физиологической, пролифера- ции клеток в сальных железа. Морфологически в исследованных образцах не было выявлено опухолевых клеток, что подтвер- ждает положительное воздействие на сальные железы клеток стромально-васкулярной фракции из пересаженного аутожира в реципиентном месте. Заключение Клиническое значение настоящего исследования заключается в том, что побочный эффект аутотрансплантации гомогенизи- рованного жира в гиподерму может оказывать терапевтическое действие для снижения пролиферативной активности сальных желез. Это может иметь положительное значение в лечении ряда кожных заболеваний, таких как себорея, акне и др. [19]. Однако это требует дополнительных экспериментальных и клинических исследований. Аутотрансплантация жира стимулирует экспрессию белка Ki-67 клетками концевых отделов сальных желез, при чем через месяц этот показатель выше в группах со`лидного графта и гомогенизированного жира, а чрез 3 и 6 месяцев – в группе измельченных скальпелем жировых графтов. Чем выше экс- прессия белка Ki-67 клетками сальных желез, тем больше их площадь, что свидетельствует о различном действии некоторых методов предоперационной обработки жировых аутотранс- плантантов на их морфофункциональную активность в месте трансплантации жира. В большей степени подобное действие оказывает трансплантация мелких жировых графтов на сроках 3 и 6 месяцев в реципиентной области.