Диаметр гемокапилляров после аутотрансплантации жира в отдаленные сроки у биологических объектов

Цель исследования: оценить диаметр микрокапилляров русла после аутотрансплантации жировых граф- тов у крыс в отдаленные постоперационные сроки. Материал и методы. Проведена морфометрическая оценка диаметра гемокапилляров и экспрессии VEGFA после липофилинга у крыс. Область трансплантации жира окрашивали кроличьими моноклональными антителами к VEGF-A и докрашивали гематоксилином Майера. Результаты. В мелких жировых графтах также, как и в сóлидных графтах, интенсивность экспрессии белка VEGF-a через 30 дней после аутотрансплантации была выше в центре графтов. Диаметр рабочих гемокапилляров был шире в сóлидном и измельченных графтах, чем в гиподерме после введения гомоге- низированного жира. Заключение. На 3-м месяце после липофилинга происходит активный процесс неоангиогенеза на пери- ферии мелких жировых графтов, что косвенно может указывать на более интенсивную интеграцию мелких жировых графтов в реципиентных тканях.
Ключевые слова: VEGF-A, аутотрансплантация жира, липофилинг, жировые графты, гемокапилляр, ангиогенез, гипоксия, некроз, ишемия, артериолы, венулы
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Финансирование. Исследование проведено без спонсорской поддержки.

Aims: to evaluate the diameter of microcapillaries in the vascular bed after fat grafting in rats in the late postoperative period. Material and methods. A morphometric assessment of the diameter of hemocapillaries and VEGF-A expression was performed after fat grafting in rats. The fat transplantation area was stained with rabbit monoclonal antibodies to VEGF-A and counterstained with Mayer’s hematoxylin. Results. In small fat grafts, as well as in solid grafts, the intensity of VEGF-a protein expression 30 days after grafting was higher in the graft center. The diameter of working hemocapillaries was wider in solid and crushed grafts than in the hypodermis after the introduction of homogenized fat. Conclusion. At three months post-lipofilling, an active process of neoangiogenesis occurs at the periphery of small fat grafts, which may indirectly indicate more intense integration of small fat grafts into recipient tissues.
Key words: VEGF-A, autologous fat transplantation, lipofilling, fat grafts, hemocapillary, angiogenesis, hypoxia, necrosis, ischemia, arterioles, venules
Conflict of interest. The authors have no conflicts of interest.
Funding. The study was conducted without sponsorship.

Введение
Изучение интенсивности васкуляризации жировых графтов при проведении липофилинга представляет собой важный вопрос [1, 2]. Проводятся исследования, направленные на пои- ски новых способов снижения потребности жирового графта в кислороде в первые постоперационные дни, увеличения нео- ангиогенеза и т.п. Изучение экспрессии маркеров ангиогенеза таких, как эндо- телиального фактора роста сосудов (VEGF-A), помогает лучше понять проблему васкуляризации жировых графтов при про- ведении липофилинга [3]. В настоящее время нет исследова- ний, изучающих экспрессию VEGF-A в отдаленном периоде при проведении липофилинга. Кроме того, в существующих работах уделяется недостаточное внимания исследованию гемоперфузии микрокапилляров в области липофилинга без дополнительного воздействия [4–6]. До конца неясным остается вопрос влияния метода предоперационной обработки жира при проведении липофилинга на васкуляризацию жирового графта в отдаленном периоде, что может иметь влияние на резорбцию жирового трансплантата и/или потерю его объема [2, 7]. В связи со значительной ролью состояния гемокапилляров для оксигенации тканей целью исследования была оценка диа- метра сосудов гемокапилляров русла после аутотранспланта- ции жировых графтов у крыс в отдаленных постоперационных сроках. Материал и методы Исследование было проведено на 65 половозрелых крысах- самцах линии Wistar. Контроль-негативную группу интактных животных составили 5 крыс, которым не проводилось никаких манипуляций (1-я группа). Вторую группу составили 15 животных, которые входили в контроль-позитивную группу. Крысам данной группы иглой 25G (D=0,5 мм) в участок кожи на холке площадью 1 см2 внутрикожно вводили 0,9% раствор хлорида натрия (0,05 мл). В 3-й группе 15 крысам вводили аутотрансплантат цельной жировой ткани в область холки через разрез длиной 5 мм (3х4х2 мм, 1,2±0,5 мг). В 4-й группе 15 крысам проводили транспланта- цию предварительно измельченной собственной жировой ткани. Также, как и в 3-й группе, трансплантировали в область холки предварительно измельченную скальпелем жировую ткань (1х2х2 мм, 1,33±0,47 мг). В 5-й группе 15 крысам проводили инъекции иглой 20G (D=1,0 мм) собственной жировой ткани, предваритель- но обработанной посредством насадки-измельчителя (Luer lock, «Microbeats», Китай), объемом 0,05 мл посредством 6 инъекций на площади 1 см2. Забор жировой ткани проводили из паховой области под общей анестезией при помощи изофлуранового наркоза (6%) в эксикаторе. Через 30, 60 и 120 дней после проведения в группах 2–5 экс- перимента проводилась эвтаназия по 5 животных. Гуманная эвтаназия осуществлялась летальными дозами раство- ра Золетила 100. У животных контроль-негативной группы (1-я группа) забирали кожу в области верхней поверхности шеи размером 1х1 см. У животных контроль-позитивной группы (2-я группа), экспериментальных групп (3–5-я группы) кожный лоскут размером 1х1 см забирали в зоне введения препаратов жировой ткани и пересадки аутотрансплантата. Срезы окраши- вали кроличьим IgG-антителом против VEGF (V-3; IBL, Fujioka, Япония) и докрашивали гематоксилином Майера. Полученные микропрепараты сканировали на микроскопе KFBIO 400 (Konfoong Biotech International Co., Ltd., КНР). Сканы анализировали при помощи программы Aperio ImageScope v12.2.2.5015 (Leica Microsystems, США). Оценивали количество VEGF-позитивных микрокапилляров в области трансплантации жировых графтов и в подкожно-жировой клетчатке (ПЖК) 3-й группы, исследовали диаметр гемокапилляров с гемоперфузией и без нее. Данные обрабатывали в программном обеспечении Microsoft Exel, MATLAB, Statistica 12.6, JASP 0.14.0.0. При сопоставлении данных группы в различные сроки после введения препаратов применяли критерий Вилкоксона. При сравнении данных экс- периментальных групп между собой и с данными контрольных групп применяли критерий Краскела–Уоллиса или критерий Манна–Уитни. Для каждого сравнения по данным статистиче- ского анализа определяли свой уровень значимости. Исследования на животных проводили согласно требованиям Приказа Министерства высшего и среднего специального обра- зования СССР №742 от 13.11.1984 «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных». Результаты Критерий Манна–Уитни показал, что на 30-й постоперацион- ный день в группе негативного контроля диаметр неактивных гемокапилляров был значимо меньше по сравнению с теми же гемокапиллярами в сóлидном графте 3-й группы, в центре и на периферии жировых графтов 4-й группы (p<0,042, p<0,037, p<0,04 соответственно) (рис. 1). Через 90 дней диаметр этих гемокапилляров был достоверно больше в сóлидном графте (3-я группа) и на периферии измельченных жировых графтов (4-я группа) (p<0,015 и p<0,032 соответственно). На 180-й день этот показатель между всеми исследуемыми группами не разли- чался (рис. 1, табл.). Критерий Краскела–Уоллиса показал, что на 30-й день после проведения эксперимента в ПЖК 3-й и 5-й групп диаметр неработающих капилляров был достоверно меньше, чем на периферии измельченных графтов 4-й группы (p<0,036 и p<0,034 соответственно). Через 90 дней данный показатель был достоверно выше в области периферии измельченного аутотрансплантата 4-й группы по сравнению с жировой тканью гиподермы в 3-й группе и группой гомогенизированного жира (5-я группа) (p<0,05) (рис. 1, табл.). Критерий Вилкоксона показал, что в графте 3-й группы диа- метр неактивных гемокапилляров значимо снизился на 90-й день по сравнению с 30-м днем после операции (p<0,018). На 180-й день их диаметр достоверно снизился по сравнению с 90-м днем (p<0,035). В центре аутотранспланата 4-й группы на 90-й день диаметр сосудов значимо снизился по сравнению с предыдущим сроком (p<0,029). На периферии измельченных графтов той же группы была выявлена отрицательная динамика по этому показателю также на 90-й день по сравнению с 3-м днем (p<0,036) (табл.). На 30-й постоперационный день, согласно критерию Манна– Уитни, в контроль-негативной группе диаметр активных гемо- капилляров был достоверно ниже, чем в графте и ПЖК 3-й группы, в центре и на периферии измельченных имплантатов 4-й группы и в гиподерме 5-й группы (p<0,00001, p<0,0061, p<0,002, p<0,00019, p<0,017 соответственно). На 90-й день этот показатель в контрольной группе был значимо ниже. По срав- нению с указанными участками реципиентной зоны в экспери- ментальных группах (p<0,0002, p<0,005, p<0,038, p<0,034, соот- ветственно). Через 180 дней после проведения хирургических вмешательств диаметр рабочих гемокапилляров в сóлидном графе, жире гиподермы 3-й группы, центре жирового графта (4-я группа) и гиподерме после введения гомогенизированного жира (5-я группа) был достоверно больше, чем в контроль- ной группе (p<0,0005, p<0,05, p<0,047, p<0,05 соответственно) (рис. 2, табл.). Критерий Краскела–Уоллиса показал, что на 30-й постопера- ционный день в сóлидном графе 3-й группы диаметр рабочих гемокапилляров был значимо выше, чем в жировой ткани гипо- дермы той же группы, в центре и на периферии измельченных жировых графтов 4-й группы и в области введения гомогенизи- рованного жира 5-й группы (p<0,0004, p<0,047, p<0,013, p<0,0001 соответственно). В центре трансплантанта 4-й группы данный показатель был достоверно выше, чем на его периферии и в группе гомогенизированного жира в остальных реципиентных зонах всех групп (p<0,009, p<0,00025 соответственно). В группе гомогенизированного жира диаметр рабочих гемокапилляров был значимо ниже, чем на периферии измельченных жировых аутотрансплантатов 4-й группы (p<0,003). Через 90 дней после проведения эксперимента в сóлидном графте этот показатель был значимо выше, чем в остальных исследуемых областях реци- пиентной зоны всех экспериментальных групп (p<0,006, p<0,009, p<0,0068, p<0,0001 соответственно). В подкожно-жировой клет- чатке 3-й группы диаметр рабочих гемокапилляров был досто- верно выше, чем в 5-й группе (p<0,038), и ниже, чем в центре и на периферии графтов 4-й группы (p<0,006 и p<0,044 соответствен- но). В центре графтов 4-й группы гемокапилляры были значимо шире, чем на своей периферии и в группе гомогенизированного жира (p<0,031 и p<0,0084 соответственно). В группе гомогени- зированного жира этот показатель был достоверно ниже, чем на периферии графтов 4-й группы (p<0,002). Через 6 месяцев в солидном графте (3-я группа) диаметр кровеносных гемока- пилляров был также, как и на предыдущих сроках, достоверно выше, чем остальных реципиентных зонах экспериментальных групп (p<0,0002, p<0,0017, p<0,0022, p<0,0008 соответственно). В ПЖК 3-й группы значения этого показателя были достоверно ниже, чем в центре измельченных графтов (4-я группа; p<0,037), гемокапилляры которых имели достоверно больший диаметр по сравнению с периферией тех же графтов той же 4-й группы и 5-й группой (p<0,04 и p<0,035 соответственно). В ПЖК 5-й группы исследуемый показатель был значимо ниже, чем на периферии жировых аутотрансплантатов 4-й группы (p<0,05) (рис. 2, табл.). Критерий Вилкоксона показал, что в сóлидном графте 3-й группы диаметр рабочих гемокапилляров значимо уменьшил- ся на 90-й день по сравнению с 30-м днем после операции (p<0,024). На 180-й день это показатель имел также отрица- тельную динамику по сравнению с 90-м днем (p<0,05). В ПЖК 3-й группы диаметр активных капилляров достоверно умень- шился по сравнению с 30-м днем (p<0,041). На 180-й день было определено, что этот показатель также продолжал уменьшаться (p<0,039). В центре аутотрансплантанта 4-й группы на 30-й день диаметр сосудов значимо снизился по сравнению с предыду- щим сроком (p<0,006). На 180-й диаметр рабочих капилляров снизился по сравнению с 90-м днем (p<0,022). На периферии измельченных графтов той же группы было выявлено снижение диаметра этих гемокапилляров на 90-й день по сравнению с 3-м днем (p<0,0017). Через 180 дней по сравнению с 90-м днем эти значения также уменьшились (p<0,0033). В 5-й группе на 30-й день этот показатель значимо снизился по сравнению 30-м днем (p<0,005) (рис. 2, табл.). Обсуждение Данное исследование первое, направленное на изучение экс- прессии VEGF-A в отдаленных сроки после проведения липо- филинга у биологических объектов. Физиологический ангиогенез и/или неоваскулярное снабже- ние необходимы для газообмена, переноса к тканям и передачи в них питательных веществ, а также удаления продуктов ката- болизма. Эти процессы необходимы для поддержания проли- ферации и выживания различных клеток и тканей [8]. Однако при нарушении регуляции роста микрокапилляров неконтроли- руемый ангиогенез становится характерным патологическим признаком иммунных нарушений, злокачественных опухолей [9]. Патологический ангиогенез, регулируемый балансом между негативными и позитивными регуляторами, в конечном итоге запускает каскад сигнальных путей, способствующих миграции эндотелиальных клеток, пролиферации и созреванию сосудов. Примечательно, что подавление любого из этих этапов подав- ляет образование новых сосудов и уменьшает аномальную неоваскуляризацию [10]. В настоящей работе экспериментально были созданы усло- вия патологического процесса с разной степенью агрессии пусть аутологичного, но трансплантата. В группах сóлидного графта имели место ишемия и гипоксия самих графтов с последующим некрозом. Во всех группах проводились либо разрезы, либо механическое раздвигание тканей реципиентного места гомогенизированным жиром инъекционным способом. В связи с этим процессы ангиогенеза необходимо рассматри- вать с точки зрения патологического процесса. Однако в связи с отдаленными сроками после проведенных хирургических вмешательств у крыс неоангиогенез следует оценивать и с физиологической точки зрения, т.к. на сроках 3 и 6 месяцев некротических изменений на микропрепаратах не наблюда- лось, но в различных группах имели место различное функци- ональное состояние гемокапилляров, и различный количест- венный и качественный состав сосудов микроциркуляторного русла. Воспаление и некроз являются мощным стимуляторами для экспрессии такого регулятора вазодилатации, как аденозин [11]. В исследовании влияния аденозина на васкуляризацию культуры жировой ткани было показано, что префабрикация аденозина в жировой ткани улучшала выживаемость транс- плантата за счет усиления ангиогенеза через ось VEGF/VEGFR в преадипоцитах и эндотелиальных клетках [12]. В настоящем исследовании было показано, что диаметр гемокапилляров в группах с жировыми графтами был шире, чем в группе гомогенизированного жира. Это косвенно свидетельствует, что происходила не только стимуляция ангиогенеза клетками стромально-васкулярной фракции (СВФ) из жировых графтов, но и регуляция диаметра гемокапилляров эндогенными фак- торами, учитывая, что в группе сóлидного жирового графта наблюдались остаточные явления некротических изменений, а в при трансплантации измельченных жировых графтов некро- за не было. Следовательно, подобная регуляция перфузии за счет сохранения стволовых клеток жировой ткани и СВФ способствовала нормальному кровоснабжению адипоцитов в графтах в средние и отдаленные сроки после проведения регуляции. Было показано, что СВФ снижает количество актив- ных форм кислорода, ослабляет экспрессию прооксидантных генов и белков с усилением экспрессии антиоксидантных генов, белков и глутатиона, но не оксида азота [13]. В том же исследовании было продемонстрировано, что кондици- онирование сред с жиром СВФ и стволовых клеток жировой ткани способствует значительной экспрессии антиоксидантных белков, что предполагает паракринный механизм регуляции сосудистого тонуса со стороны клеток СВФ. Вазодилатация обеспечивается за счет агонизма этих факторов по отноше- нию к β1-адренорецепторам микрососудов [13]. СВФ снижа- ет окислительный стресс, стимулирует вазодилатацию [14], опосредованную β1-адренорецепторами [15]. Таким образом, введение аутологичного жира при липофилинге, содержащего значительную долю клеток СВФ, способствует физиологиче- ской перфузии жировой ткани и адипогенезу. Ограничения исследования Исследование было направлено на морфометрический анализ размеров сосудов микроциркуляторного русла в месте трансплан- тации жировых графтов без учета состояния общей регуляции организма – без анализа состояния вегетативной нервной систе- мы и концентрации биологических активных веществ, регулирую- щих диаметр сосудистого русла. Будущие исследования должны учесть не только базовые регуляторные механизмы состояния микроциркуляторного звена кровеносной системы, но и факторы, улучшающие приживляемость графтов, факторов, снижающих гипоксию и улучшающих гемодинамику в месте пересадки жира, а также оценить влияние экспрессии кофакторов ангиогенеза на состояние гемокапилляров и их гемопрефузию. Заключение В мелких жировых графтах также, как и в сóлидных графтах, интенсивность экспрессии белка VEGF-a через 30 дней после аутотрансплантации выше в центре графтов. Диаметр рабочих гемокапилляров шире в сóлидном и измельченных графтах, чем в гиподерме после введения гомогенизированного жира. На 3-м месяце после липофилинга происходит активный процесс неоангиогенеза на периферии мелких жировых графтов, что косвенного может указывать на более интенсивную интеграцию мелких жировых графтов в реципиентных тканях.