Циркулирующие микроРНК как фактор риска рецидива рака щитовидной железы

Цель исследования. Оценить прогностическую значимость изменения экспрессионной активности микроРНК (миРНК) в сыворотке крови в динамике наблюдения пациентов со злокачественными образованиями щитовидной железы (ЩЖ) после радикальных операций для стратификации опухолей высокого и низкого рисков рецидивирования.

Материал и методы. В исследование были включены 138 пациентов с узловыми образованиями ЩЖ по итогам ультразвукового исследования и неопределенным цитологическим заключением по материалам тонкоигольной аспирационной биопсии (ТАБ) (III–V категории по классификации Bethesda). Всем больным проводили хирургическое лечение с гистологическим исследованием операционных образцов ткани ЩЖ. У 63 (45,7%) пациентов выявлены злокачественные образования ЩЖ, а у 75 (54,3%) – доброкачественные. По частоте преобладали (n=44) начальные стадии злокачественного заболевания Т1-2N0M0. Экспрессию миРНК оценивали в тонкоигольном аспирате из узла ЩЖ и в сыворотке крови методом ПЦР в режиме реального времени. Оценка изменения экспрессии каждой миРНК в субстрате проводили путем определения dCt относительно референсной миРНК-7a (Lеt-7a). Экспрессию миРНК в сыворотке крови определяли в динамике через 6, 12, 18 месяцев после операции и проводили сравнение параметров в зависимости от наличия или отсутствия рецидива заболевания.

Результаты. Наиболее выраженные различия экспрессии миРНК в образцах доброкачественных и злокачественных узлов ЩЖ, сыворотки крови отмечены для миРНК-146b, миРНК-222, миРНК-221. За 2 года наблюдения рецидивы онкологического заболевания выявили у 7 (11,1%) больных. При рецидивировании рака ЩЖ через 6 месяцев после операции экспрессия миРНК-146b и миРНК-221 возрастала, а при отсутствии рецидива снижалась по сравнению с дооперационным уровнем. На этом же этапе наблюдения установлено однонаправленное снижение экспрессии миРНК-222 в сыворотке крови в двух подгруппах, но величина экспрессии изучаемого маркера при рецидиве заболевания была выше по сравнению с пациентами с безрецидивным течением болезни: 0,56 [0,25–0,73] против 0,24 [0,13–0,36], р=0,048. Аналогичный характер изменения экспрессии миРНК в крови установлен и через 12 месяцев после операции.

Заключение. Оценка экспрессии миРНК-146b, миРНК-221 и миРНК-222 в сыворотке крови до операции и через 6 и 12 месяцев после ее выполнения имеет прогностическую значимость. При повышении послеоперационного уровня экспрессии изучаемых миРНК относительного исходного параметра риск рецидива высокий, что является основанием для последующего повышения кратности послеоперационного обследования пациента.

Ключевые слова: рак щитовидной железы, рецидив, микроРНК, экспрессия, тонкоигольная аспирационная биопсия, сыворотка крови, мониторинг, молекулярно-генетическое исследование

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Финансирование. Работа выполнена без спонсорской поддержки.

Purpose of the study. To assess the prognostic significance of changes in the expression of microRNAs (miRNAs) in blood serum during the follow-up of patients with malignant tumors of the thyroid gland (thyroid) after radical surgery in order to identify tumors with high and low risk of recurrence.

Material and methods. The study included 138 patients with thyroid nodules identified by ultrasound examination and with an indeterminate cytological report based on fine-needle aspiration biopsy (FNA) (category III-V according to the Bethesda classification). All patients underwent surgical treatment with histological examination of surgical samples of thyroid tissue. Malignant thyroid masses were detected in 63 (45,7%) patients, and benign lesions in 75 (54,3%). Most patients had the initial stages of the malignancy T1-2N0M0 (n=44). The expression of miRNAs was assessed in fine needle aspiration material from the thyroid nodules and in blood serum using real-time PCR. The change in the expression of each miRNA in the substrate was assessed by determining the dCt relative to the reference miRNA-7a (Let-7a). The expression of miRNAs in blood serum was determined over time at 6, 12, 18 months after surgery, and parameters were compared depending on the presence or absence of the disease relapse.

Results. The most pronounced differences in miRNA expression between the samples of benign and malignant thyroid nodules, in the blood serum samples were noted for miRNA-146b, miRNA-222, miRNA-221. During two years of observation, cancer relapse was detected in 7 (11,1%) patients. When thyroid cancer relapsed 6 months after surgery, the expression of miRNA-146b and miRNA-221 increased, while in the absence of relapse it decreased compared to the preoperative level. At the same stage of observation, a unidirectional decrease in the expression of miRNA-222 in the blood serum was established in two subgroups, but the expression value of the marker during disease relapse was higher compared with the relapse-free patients (0,56 [0,25-0,73] versus 0,24 [0,13-0,36], p=0,048). A similar pattern of changes in miRNA expression in the blood was established 12 months after surgery.

Conclusion. Assessment of the expression of miRNA-146b, miRNA-221, and miRNA-222 in blood serum before surgery and 6 and 12 months after surgery has prognostic significance. With an increase in the postoperative level of expression of the studied miRNAs relative to the initial value, the risk of relapse is high, which justifies a subsequent increase in the frequency of postoperative patient examinations.

Key words: thyroid cancer, relapse, microRNA, expression, fine-needle aspiration biopsy, blood serum, molecular genetic study

Conflicts of interest. The authors have no conflicts of interest to declare.

Funding. There was no funding for this study

Введение Тонкоигольная аспирационная биопсия (ТАБ) щитовидной железы (ЩЖ) с последующим цитологическим исследованием аспирата относится к высокоинформативным диагностиче ским методам выявления злокачественных образований [1]. Однако при неопределенном цитологическом заключении, встречающемся в 30% случаев, диагностика рака ЩЖ, а тем более прогноз течения заболевания, крайне затруднительны [2]. Несмотря на благоприятное течение преобладающего числа гистологических типов рака ЩЖ, рецидивы заболева ния встречаются в 30% наблюдений [3]. Для формирования прогноза течения злокачественного заболевания кроме ста дии болезни и гистологического типа важен учет результа тов молекулярногенетического исследования биоптатов [4, 5]. Однако в отношении рака ЩЖ анализ известных сома тических мутаций не предоставляет информацию о риске рецидивирования или метастазирования заболевания [6]. Информация такого рода важна для оценки риска развития самой онкологической патологии. Данное обстоятельство обусловливает актуальность поиска новых информативных неинвазивных маркеров для оценки риска рецидивов рака ЩЖ при мониторировании состояния пациентов после выполнения радикальных операций. МикроРНК (миРНК) представляют собой короткие эндогенные некодирующие молекулы, которые регулируют экспрессию генов на посттранскрипционном уровне и могут активировать множество онкогенных путей при различных формах рака [7]. миРНК связываются с соответствующими им транскриптами, препятствуя их трансляции или вызывая их деградацию, тем самым модулируя клеточные пути онкогенеза [8]. Аберрантная экспрессия миРНК часто наблюдается при злокачественных заболеваниях [9]. Следовательно, дифференциальная экспрес сия миРНК считается опухолеспецифичным явлением, кото рое может отражать поведение опухоли [10]. Соответственно, отдельные миРНК имеют клиническое применение в качестве диагностических либо прогностических маркеров или инстру ментов для оценки стадии или прогрессирования заболевания [11, 12]. МиРНК через регуляцию сигнальных путей связаны с пролиферацией, инвазией или метастазированием опухолей, что указывает на то, что миРНК могут рассматриваться как прогностические биомаркеры при раке [13]. Циркулирующие миРНК являются идеальными маркерами для неинвазивного контроля течения заболевания, поскольку экспрессия миРНК является опухолеспецифичной и последовательно отражает картину заболевания [14]. В ранее проведенных исследованиях выявлено, что опреде ленные миРНК имеют повышенную или сниженную экспрессию при раке ЩЖ по сравнению со здоровым контролем [15,16]. Таким образом, миРНК в различных биологических средах могут быть использованы для реализации диагностических задач. Целью данного исследования было оценить прогностическую значимость изменения экспрессионной активности миРНК в сыворотке крови в динамике наблюдения пациентов со зло качественными образованиями ЩЖ после радикальных опе раций для стратификации опухолей высокого и низкого риска рецидивирования. Материал и методы В исследование включены 138 пациентов с узловыми образо ваниями ЩЖ по итогам ультразвукового исследования (УЗИ) и неопределенным цитологическим заключением по материалам ТАБ (III–V категории по классификации Bethesda). Число мужчин составило 44 (31,9%), а женщин – 94 (68,1%). Возраст пациентов колебался от 39 до 76 лет, в среднем составив 48,9±2,8 года. Критерии включения пациентов в исследование: узловые образования ЩЖ по результатам УЗИ, неопределенное цито логическое заключение по материалам ТАБ (III–V категории по классификации Bethesda), хирургическое лечение с гистоло гическим исследованием операционных образцов ткани ЩЖ. Критерии исключения: специфическое противоопухолевое лечение на момент исходного исследования миРНК в крови и в операционных образцах ткани, онкологические заболевания иной локализации. По итогам гистологического исследования операционных образцов ЩЖ у 63 (45,7%) пациентов выявлены злокачест венные образования ЩЖ, а у 75 (54,3%) – доброкачественные образования. Среди злокачественных образований ЩЖ по гистологическому типу выделяли папиллярную карциному – 32 (50,8%), фолликулярную карциному – 13 (20,6%), фолликуляр ный вариант папиллярной карциномы – 12 (19,1%), медулляр ную карциному – 6 (9,5%). По частоте преобладали начальные стадии заболевания Т12N0M0 (n=44). Более поздние стадии рака ЩЖ (Т3а) были диагностированы у 19 (30%) больных. Среди доброкачественных образований ЩЖ (n=75) преи мущественно встречалась фолликулярная аденома (n=71) и в редких случаях – оксифильная аденома (n=4). По результатам молекулярногенетического исследования аспирата у пациентов со злокачественными образованиями ЩЖ (n=63) отсутствие мутаций V600Е гена BRAF, а также генов NRAS, HRAS, KRAS установлено у 31 (49,2%) пациента, а наличие мутаций – у 32 (50,8%) больных. УЗИ ЩЖ осуществляли на аппарате Minifocus 1402 фирмы «BK Medical» (Дания) датчиком, работающим с частотой 12 МГц. При ТАБ использовали одноразовые иглы 21G (длина 5 см) и иглы 20G (длина 10 см) в зависимости от глубины залегания узла. Цитологический материал на стекле высушивали естест венным образом и окрашивали по Майн–Грюнвальду–Гимзе, а далее исследовали с помощью световой микроскопии. Заключение об отсутствии мутаций V600Е гена BRAF, а также генов NRAS, HRAS, KRAS, хромосомных перестроек RET/PTC и PAX8/PPARG формировали по итогам молекулярногенетиче ского исследования аспирата методом обратной гибридизации продуктов мультиплексной полимеразной цепной реакции (ПЦР) с помощью диагностической панели ThyGenX TEST (Interpace Diagnostic, США). Экспрессию миРНК оценивали в тонкоигольной аспирате из узла ЩЖ и в сыворотке крови. Тотальную миРНК выделяли с помощью набора реагентов PureLink RNA Mini Kit (Thermo Scientific, США). Общую концентрацию и оценку качества выделенной РНК проводили на спектрофотометре NanoDrop 2000C (Thermo Scientific, США). Путем обратной транскрипции получали кДНК, используя набор компании «АльгимедТехно» (Беларусь). Оценка изменения экспрессии каждой миРНК в суб страте исследовалась методом dCt относительно референсной миРНК7a (Lеt7a) (dCt=2(Ct миРНКX – Ct миРНК7а)). Гистологическое исследование операционных образцов расценивали как «золотой стандарт» диагностики, с которым сравнивали результаты оценки экспрессии миРНК в цитологи ческом материале и сыворотке крови до операции. С целью предварительного начального профайлинга опу хольассоциированных миРНК для ЩЖ были приготовлены т.н. «пулы». Из 75 образцов РНК, полученных из доброкачественных узлов ЩЖ, смешанных в эквимолярных количествах, готовили пул «доброкачественных узлов ЩЖ». Аналогично объединяли РНК в пул «злокачественные узлы» от 63 больных. Экспрессию миРНК в сыворотке крови определяли в дина мике через 6, 12, 18 месяцев после операции. В течение 2 лет после радикального хирургического вмешательства выявляли наличие рецидивов онкологического заболевания. В качестве рецидивов рассматривали случаи местного рецидива, поражение регионарных лимфоузлов, отдаленные метастазы. Сведения о динамике экспрессии миРНК в сыворотке крови сопоставляли в двух подгруппах пациентов в зависимости от наличия или отсутствия рецидива онкологического заболевания. Статистическую обработку результатов осуществляли с по мощью модулей описательной статистики, логистического рег рессионного анализа программы Statistica 12.0 (StatSoft, США). Результаты По результатам сравнительного анализа экспрессионной активности 170 миРНК диагностической панели ПЦР miRCURY LNA miRNA в ТАБ ЩЖ были выявлены статистически значимые изменения относительно 22 миРНК в злокачественных и добро качественных образованиях ЩЖ: миРНК723p, 30d, 1395p, 1455p, 146b, 148b3p, 155, 182, 183, 199а5р, 199а3р, 187, 197, 221, 222, 224, 4553р, 4555р, 484, 5425р, 5743р, 8855р (табл. 1). Наиболее выраженные различия экспрессии миРНК в образ цах доброкачественных и злокачественных узлов ЩЖ отмечены для четырех миРНК – миРНК8855р, миРНК146b, миРНК222, миРНК221. Относительный показатель или кратность измене ния экспрессии миРНК в ткани злокачественной опухоли по отношению к аналогичному показателю в доброкачественной опухоли для миРНК8855р составил 17,2 (p<0,001), миРНК146b – 11,3 (p<0,001), миРНК222 – 9,9 (p<0,001) и миРНК221 – 7,6 (p<0,001) (табл. 1). Экспрессия четырех миРНК до операции была исследована и в образцах сыворотки крови (табл. 2). Установлено, что экспрессия трех маркеров – миРНК146b, миРНК222 и миРНК221 в крови у больных злокачественными опухолями была выше (p<0,05) по сравнению c пациентами с доброкачественной патологией ЩЖ. МиРНК экспрессируются не только в клетках, включая опухо левые, но и образуют циркулирующий пул в различных жидких средах организма (кровь, синовиальная жидкость, плевральная жидкость, десневая жидкость и др.). В крови циркулирующие миРНК в отличие от матричных РНК связаны с белками, заклю чены в эндосомы или микровезикулы, что объясняет их устойчи вость к нуклеазам. Циркулирующие миРНК не являются прямы ми продуктами жизнедеятельности опухолевых клеток, поэтому отдельные молекулы при злокачественных заболеваниях могут одновременно сверхэкспрессироваться как в опухолевых клетках, так и в кровотоке (миРНК146b, миРНК222 и миРНК221), а другие миРНК дифференциально экспрессируются только в опухолевых клетках (миРНК8855р). Далее у 63 пациентов с раком ЩЖ экспрессию циркулирую щих миРНК определяли после выполнения радикальной опера ции каждые 6 месяцев в течение двух лет. За 2 года наблюдения рецидивы онкологического заболевания выявили у 7 (11,1%) больных: у 4 больных медуллярной карциномой, 2 пациентов с фолликулярным и у одного больного папиллярным раком ЩЖ. Отмечали местные рецидивы, поражение шейных и подключич ных лимфатических узлов, один отдаленный метастаз в легкие в сроки, начиная от 6 месяцев после операции. Ретроспективно рассчитывали величины экспрессии миРНК в крови в динамике наблюдения с учетом наличия или отсутствия рецидива забо левания у пациентов (табл. 3). По итогам анализа было выявлено, что при рецидивиро вании рака ЩЖ через 6 месяцев после операции экспрессия миРНК146b и миРНК221 возрастала, а при отсутствии реци дива снижалась по сравнению с дооперационным уровнем. На этом же этапе наблюдения установлено однонаправленное снижение экспрессии миРНК222 в сыворотке крови в двух подгруппах, но величина экспрессии изучаемого маркера при рецидиве заболевания была выше по сравнению с пациентами с безрецидивным течением болезни: 0,56 [0,25–0,73] против 0,24 [0,13–0,36], р=0,048. Аналогичный характер изменения экспрессии миРНК в крови установлен и через 12, а также 18 месяцев после операции. Различная динамика накопления изучаемых миРНК в сыворотке крови больных после операции может быть связана как с дифференциальным уровнем их гиперэкспрессии в тканях, так и с уровнем их связывания с белками в циркулирующих жидкостях, различной востребо ванностью для регуляции клеточной пролиферации, инвазии опухолевых клеток, эпителиальномезенхимального пере хода и других процессов, связанных с прогрессированием заболевания. Оценка относительного изменения экспрессии миРНК в крови после операции по сравнению с исходной величиной, выраженная в процентном соотношении, ненадежна, посколь ку зависит от исходного абсолютного значения показателя. В связи с этим кратность изменения экспрессии маркеров была прологарифмирована, что стандартизировало динами ку параметров. Относительный индекс изменения экспрессии миРНК146b, миРНК222 и миРНК221 через 6 и 12 месяцев после операции по сравнению с исходным уровнем представлен на рисунке. У больных раком ЩЖ наиболее выраженные изменения в крови при рецидивировании заболевания отмечены для уровня миРНК221 и миРНК146b (рис. 1). Таким образом, изменение экспрессии миРНК146b, миРНК 222 и миРНК221 в биоптате и сыворотке крови информативно для дифференциальной диагностики доброкачественных и злокачественных образований ЩЖ до операции. С высоким риском рецидивирования рака ЩЖ было сопряжено повышение экспрессии миРНК146b и миРНК221 в сыворотке крови через 6 месяцев после операции. При низком риске рецидивов рака ЩЖ после операции экспрессия миРНК146b и миРНК221 снижалась относительно исходного уровня. В ранее проведенных исследованиях выявлено, что миРНК 221 и 222 сверхэкспрессируются в раковых клетках карциномы ЩЖ и связаны с агрессивными опухолями, неблагоприятными клиническими характеристиками заболевания [17, 18]. Молекула миРНК146b играет важную роль в прогрессировании опухоли, подавляя BRCA1 [19]. МиРНК222 и 221 способствуют мигра ции и инвазии раковых клеток [20]. Существует выраженная корреляция между уровнями миРНК в сыворотке крови и опу холевой ткани для различных опухолей [9] и рака ЩЖ в част ности [15, 18]. В проведенном нами исследовании установлен факт многократно повышенной экспрессии миРНК8855р, миРНК146b, миРНК222, миРНК221 в аспирационном биоп тате у больных раком ЩЖ с одновременным превышением параметра в сыворотке крови для миРНК146b, миРНК222 и миРНК221. Полученные результаты свидетельствуют, что повышение экспрессионной активности миРНК146b, 222 и 221 в крови у больных раком ЩЖ сопряжено с риском рецидива. Данный комплекс дифференциально экспрессируемых миРНК обнару живается в кровотоке пациентов с раком ЩЖ и способствует выявлению высокого риска прогрессирования заболевания. Заключение Профилирование экспрессии миРНК имеет не только диаг ностическую ценность, но позволяет мониторировать, а также прогнозировать прогрессирование злокачественного процесса в ЩЖ. Полученные результаты исследования являются осно ванием для рекомендации оценивать экспрессию миРНК146b, миРНК221 и миРНК222 в сыворотке крови у больных раком ЩЖ до операции, а также через 6 и 12 месяцев после ее выпол нения с помощью метода ПЦР в режиме реального времени. При повышении послеоперационного уровня экспрессии миРНК 146b и миРНК221 через 6 и 12 месяцев, а для миРНК222 спустя 12 месяцев относительного исходного параметра риск рецидива рассматривать как высокий с последующим повыше нием кратности послеоперационного обследования больных. Через 18 месяцев различия экспрессии миРНК146b, миРНК221 и миРНК222 в подгруппах в зависимости от наличия или отсутствия рецидива достигают максимума, но предсказательная значимость исследований в отдаленный период снижается ввиду удлинения срока наблюдения за пациентами. В связи с этим прогноз развития рецидива заболевания рекомендуется формировать на основе оценки динамики экспрессии миРНК 146b, миРНК221 и миРНК222 в первые 12 месяцев после операции.