Ангиогенез аутотрансплантата жировой ткани после различных методов предоперационной обработки жира у крыс

В статье представлены исследования ангиогенеза в аутотрансплантате жировой ткани после различных методов ее предоперационной обработки (солидный графт, измельчение скальпелем, гомогенизированный жир при помощи шприца Луэр лок) у крыс на сроках 30, 90 и 180 дней после проведения моделирования липофилинга. Показано, что через 30 дней число сосудов микроциркуляторного русла (МЦР) в реципиентном месте значимо было в группе с измельченным жиром (p<0,05) по сравнению с солидным графтом. Через 90 дней наименьшая доля сосудов МЦР была в группе гомогенизированного жира (p<0,01). Через 180 дней после моделирования липофилинга наибольшее число сосудов МЦР наблюдалось в группе гомогенизиро- ванного жира по сравнению с группой измельченного жира (p<0,001). Во всех группах доля сосудов МЦР с 30-го по 180-й дни достоверно уменьшалась. Наилучшая васкуляризация жировой ткани на сроке 180 дней после проведения моделирования липофилинга у крыс наблюдается после трансплантации гомогенизи- рованного жира. Ключевые слова: липофилинг, жировой графт, неоангиогенез, микроциркуляторное русло Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Финансирование. Работа выполнена без спонсорской поддержки.

The article presents studies of angiogenesis in the autologous adipose tissue graft after various methods of its preoperative processing (solid graft, fragmenting with a scalpel, fat homogenized using a Luer Lock syringe) in rats at 30, 90 and 180 days after lipofilling simulation. We found that the number of microcirculatory vessels (MCVs) in the recipient site after 30 days was significantly lower in the fragmented fat group (p<0.05) compared with the solid graft group (p<0.05). After 90 days, the lowest proportion of MCVs was in the homogenized fat group (p<0.01). At 180 days after simulated lipofilling, the highest number of MCVs was observed in the homogenized fat group compared with the fragmented fat group (p<0.001). In all groups, the proportion of MCVs decreased significantly from day 30 to day 180. The best vascularization of adipose tissue at 180 days after lipofilling simulation in rats was observed with the transplantation of homogenized fat. Key words: lipofilling, fat graft, neoangiogenesis, microvasculature Conflicts of interest. The authors have no conflicts of interest to declare. Funding. There was no funding for this study

Введение. Неоваскуляризация представляет собой сложный процесс, включающий согласованное взаимодействие между различными ангиогенными факторами, включая эндотелиальный фактор рост (ЭФР) и Ang-1. ЭФР считается основным стимулирующим факто- ром образования новых кровеносных сосудов из известных науке. Будучи мощным митогеном, он может стимулировать пролифера- цию, миграцию и неоваскуляризацию эндотелиальных клеток [1, 2]. Кроме того, было также обнаружено, что ЭФР может регулировать метаболический гомеостаз в жировых тканях [3–7]. Таким образом, многие исследования подтверждают, что ЭФР может повысить выживаемость и качество жировых трансплантатов [8–10]. Пересадка жировой ткани, особенного целикового графта, не подразумевает пересадку на питающей ножке или создание последующего сосудистого анастамоза в реципиентном месте. Подобный дефицит сосудов влечет за собой ишемию, а затем и гипоксию. Ишемия и последующая гипоксия провоцируют запуск механизмов апоптоза. Гипоксия приводит к некрозу, но одновременно с этим запускает ангиогенез в трансплантате. Некротизированная ткань, как правило, замещается соедини- тельной тканью, в частности рубцом, и впоследствии может также васкуляризироваться. Вновь образованные сосуды питают трансплантат и вновь образованные из стромально-васкулярной фракции адипоциты [11, 12]. На сегодняшний день не вполне ясно, каким образом влияет метод обработки жировой ткани на ее реваскуляризацию при проведении липофилинга. Цель исследования: изучить ангиогенез в аутотрансплантатах жировой ткани после различных методов ее предоперационной обработки (солидный графт, измельчение скальпелем, гомо- генизированный жир при помощи шприца Луэр лок) у крыс на сроках 30, 90 и 180 дней после проведения моделирования липофилинга. Материал и методы Моделирование операций. В исследовании было изуче- но 50 половозрелых крыс-самцов линии Wistar. Контроль- негативную группу интактных животных составили 5 крыс, которым не проводили никаких манипуляций (1-я группа). Вторую группу составили 15 животных, которые входили в контроль-позитивную группу. Этим животным вводили 0,9% раствор хлорида натрия. В 3-й группе было задействовано 15 крыс, которым вводили аутотрансплантат цельной жировой ткани. Крысам данной группы в область холки через разрез длиной 5 мм вводили цельный, необработанный жировой аутотрансплантант, средняя масса которого в группе составила 1,2±0,15 мг. В 4-й группе 15 крысам проводили трансплан- тацию предварительно измельченной собственной жировой ткани. Крысам данной группы в область холки через разрез 0,5 см вводили предварительно измельченную скальпелем жировую ткань массой 1,33±0,17 мг. Размер вводимых жиро- вых графтов был 1х2 мм. В 5-й группе 15 крысам проводили инъекции собственной жировой ткани, предварительно обра- ботанной с помощью насадки-измельчителя. Крысам данной группы через иглу 20G (D=1мм) в области холки внутрикожно вводили препарат собственной жировой ткани. Объем одной инъекции составлял 0,25 мл, всего 6 инъекций на площадь 1 см2. Извлеченную из паховой области жировую ткань промы- вали охлажденным физиологическим раствором, после чего выкладывали на предметное стекло и разрезали на несколько частей. Разрезанную жировую ткань помещали в шприц Луер лок (2 мл), который соединяли со вторым таким же шприцом посредством навинчивающейся насадки-измельчителя из хирургической стали (производ. «Microbeats», Китай). Насадка содержала съемный стальной фильтр, диаметр которого постепенно уменьшали с 2,4 до 0,2 мм. Жир прогоняли через насадку-измельчитель из одного шприца в другой нажатием на поршень шприца. Критерием готовности материала была его способность проходить через иглу шприца диаметром 0,6 мм. По окончании процедуры насадку-измельчитель отвинчивали и на ее место навинчивали иглу 0,6 мм для внутрикожного введения биоматериала крысе. Всем крысам 2-й–5-й групп манипуляции проводили под общей анестезией путем изофлу- ранового наркоза (6%) в эксикаторе. Забор материала и гистологическая техника. Через 30, 90 и 180 дней во 2-й–5-й группах пяти животным проводилась гуманных эвтаназия токсичными дозами раствора Золетил 100 (20 животных на срок). Забирали кусок кожи с подлежа- щими тканями в области трансплантации аутожира размером 1,5х1,5х0,7 см. Ткани фксировали в 10% растворе забуферен- ного формалина, далее заливали парафином в специальные кассеты. Окрашивание срезов проводили гематоксилином и эозином, а также по Маллори стандартными методиками. Статистичекий анализ. Данные обрабатывали в программном обеспечении Microsoft Exel, statistica 12.6, JASP 0.14.0.0. При сравнении данных экспериментальных групп между собой и с данными контрольных групп использовали критерий Манна– Уитни. Для каждого сравнения определяли свой уровень зна- чимости (р< от 0,001 до 0,05). Результаты Доля сосудов в области введения 0,9% раствора хлорида натрия в контроль-позитивной группе не отличалась от таковой в контроль-негативной группе. Сравнение динамики изменения относительного числа сосу- дов микроциркуляторного русла (МЦР) внутри групп показало, что в 3-й группе, согласно U-критерию Манна–Уитни, на 90-й и 180-й дни после моделирования липофилинга значения этого показателя были значимо ниже, чем на 30-й день (p<0,01). В группе с измельченным жиром (4-я группа) процент числа сосудов МЦР был значимо ниже на 90-й (p<0,01) и на 180-й дни (p<0,05), чем на 30-й постоперационный день. В группе гомо- генизированной жира (5-я группа) доля сосудов МЦР в месте липофилинга на 90-й день снизилась, по сравнению с 30-м днем (p<0,001). На 180-й день этот показатель был значимо выше, чем на 90-й день (p<0,05). Через 30 дней после моделирова- ния липофилинга у животных экспериментальных групп доля сосудов МЦР была значимо выше по сравнению с группами контроля (p<0,001). Согласно критерию Манна–Уитни, у крыс 3-й группы доля сосудов в области имплантации жировой ткани была значимо ниже по сравнению с группой измельченного жира (4-я группа; p<0,05, рис. 1, табл. 1). Через 90 дней в контрольных группах число сосудов МЦР было значимо ниже, чем в 3-й группе (p<0,01), и выше, чем в 5-й группе (p<0,05). В группе измельченного жира данный показатель был значимо ниже, чем в группе целикового граф- та (p<0,05), и выше, чем в группе гомогенизированного жира (p<0,01, рис. 1, табл. 1). После 6-месячного постоперационного периода контрольные и экспериментальные группы по доли сосудов микроциркулято- рого русла не различались. Согласно U-критерию Манна–Уитни, в 4-й группе значения этого показателя были достоверно ниже, чем в 3-й (p<0,05) и 5-й группах (p<0,001, рис., табл.). Обсуждение Многочисленные исследования показали, что жировая ткань является весьма активной в биологическом смысле видом соединительной ткани. Ее стромально-васкулярная фракция содержит мультипотентные мезенхимальные стволовые клет- ки (МСК) и большую популяцию клеток-прогениторов, в т.ч. и предшественников адипоцитов [13]. Возможности МСК жиро- вой ткани выходят за рамки локальных влияний – стимуляция ангиогенеза, ремоделирование фиброзной ткани, стимуляция раневого заживления, модуляция воспалительного и иммунного ответов и др. По результатам гистологического исследования эпидермиса животных через 90 и 180 дней в дерме оценивали долю сосу- дов МЦР в %. В дерме опытных животных доля сосудов также возрастала. Число и площадь сально-волосяных комплексов в опытных группах было больше, возможно, за счет улучшения общих показателей кожи. Подкожная жировая основа выявлялась практически у всех животных опытных групп при отдаленных сроках (кроме 1 животного 5-й группы на сроке 180 дней). Наилучшие пока- затели были определены в 3-й и 4-й опытных группах, где животным имплантировали внутрикожно аутографт и жир, измельченный с помощью скальпеля. Возможно, при транс- плантации жира в крупных фракциях аутотрансплантат не может быть достаточно обеспечен сосудами для обеспечения его кро- воснабжения, а значит интеграцией с реципиентными тканями. Это приводит к некрозу [12], который мы описывали на ран- них сроках исследования. Некроз и воспаление (повреждение) в области трансплантации, возможно, являются факторами, инициирующими дифференцировку и пролиферацию гетеро- генного компонента стромально-васкулярной фракции жировой ткани в липобласты, фибробласты, эндотелиальные клетки и др. [11]. Следует отметить, что через 180 дней жировая ткань оказалась сохранна, хорошо васкуляризирована, с адипоцитами вариабельных размеров (в пределах нормы), что характерно для подкожной жировой основы. Заключение Во всех группах доля сосудов МЦР с 30-го по 180-й дни достоверно уменьшалась. Наилучшая васкуляризация жировой ткани на сроке 180 дней после проведения моделирования липофилинга у крыс наблюдалась после трансплантации гомо- генизированного жира.