Изменения структуры натрий-калиевого насоса в различных отделах головного мозга у крыс после введения нейротоксина 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридина

Введение. Многообразие немоторных нарушений болезни Паркинсона на доклинической стадии развития заболевания делает актуальным поиск адекватных и простых способов их моделирования на грызунах. Подкожное или внутрибрюшинное введение нейротоксина 1-метил-4- фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридина (МФТП) мышам является одной из наиболее распространенных моделей экспериментального паркинсо- низма на грызунах. Интраназальное введение данного нейротксина крысам остается менее изученным, но перспективным способом вызвать у животных умеренное повреждение дофаминергических нейронов головного мозга без моторной симптоматики.
Материал и методы. МФТП вводили интраназально 28 крысам Wistar. Через 16 дней извлекали 9 структур головного мозга и методом Вестерн–Блоттинга оценивали содержание трех α-субъединиц Na/K-АТФазы.
Результаты. Установлено, что однократное интраназальное введение нейротоксина крысам привело к снижению содержания α1- и α2- субъедениц и росту числа α3-субъедениц Na/K-ATФазы в различных отделах коры головного мозга крыс, в т.ч. в обонятельных луковицах. В подкорковых структурах изменения были выявлены только в стриатуме и гиппокампе.
Выводы. Полученные данные позволяют предположить изменение функциональной активности нейронов го- ловного мозга в структурах, связанных с выработкой и воспроизведением инструментальных рефлексов у крыс. Ключевые слова: паркинсонизм, МФТП, интраназальное введение, Na/K-ATФаза
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Финансирование. Исследование выполнено в рамках научного проекта государственного задания МГУ имени М.В. Ломоносова (тема №121032500080-8).

Introduction. The variety of non-motor symptoms at the preclinical stage of Parkinson’s disease makes it relevant to search for adequate and simple methods for their modeling in rodents. Subcutaneous or intraperitoneal administration of the 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) neurotoxin to mice is one of the most common models of experimental parkinsonism in rodents. Intranasal administration of this neurotoxin to rats remains a less studied but promising way to induce moderate damage to brain dopaminergic neurons without causing motor symptoms in animals.
Material and methods. MPTP was administered intranasally to 28 Wistar rats. After 16 days, 9 brain structures were extracted and the content of three α-subunits of Na/K-ATPase was evaluated by Western Blotting.
Results. We found that a single intranasal administration of neurotoxin to rats led to a decrease in the content of α1- and α2-subunits and an increase in the content of α3-subunits of Na/K-ATPase in various parts of the rat cerebral cortex, including the olfactory bulbs. In subcortical structures, changes were found only in the striatum and hippocampus.
Conclusions. The obtained data suggest a change in the functional activity of brain neurons in the structures associated with the acquisition and execution of instrumental reflexes in rats. Key words: parkinsonism, MPTP, intranasal, Na/K-ATPase
Conflicts of interest. The authors have no conflicts of interest to declare.
Funding. The research was carried out within the framework of the scientific project of the state assignment of the Lomonosov Moscow State University (No.121032500080-8).

Введение Болезнь Паркинсона (БП) является вторым по распростра- ненности нейродегенеративным заболеванием после болезни Альцгеймера. Ведущей симптоматикой БП являются моторные нарушения в виде брадикинезии, мышечной ригидности и тремора покоя. Болезнь сопровождает широкий спектр немоторных симптомов. К ним относятся психические и когнитивные нару- шения, вегетативные, болевые и сенсорные [1]. Особенностью немоторных симптомов является их раннее появление (за годы до моторных), когда существенной гибели дофаминергических нейронов черной субстанции еще не происходит. Стандартные методики моделирования БП на грызунах с использованием нейротоксинов нацелены на гибель столь суще- ственного числа дофаминергических нейронов (>90%), что их можно соотнести с уже развернутой картиной заболевания. Для моделирования ранней стадии БП с помощью уже известных нейротоксинов (МФТП, 6-OHDA, ротенон) обычно используется 2 подхода – снижение дозировки или выбор альтернативного спо- соба их введения [2]. Одним из таких методов является интра- назальное введение МФТП крысам [3]. Ранее было показано, что в данной модели хорошо воспроизводится окислительный стресс [4] и умеренное снижение уровня дофамина в черной субстанции и стриатуме [5]. Развиваются и нарушения обуче- ния в виде снижения скорости выработки и воспроизведения инструментальных рефлексов [6]. В большинстве исследований паркинсоноподобного синдрома на грызунах и приматах акцент делается на молекулярных механизмах, связанных с оксидатив- ным стрессом. Исследований, посвященных структурным или функциональным изменениям Na+/K+-АТФ-азы в головном мозге крыс на ранней стадии паркинсонизма, проведено не было. Цель исследования: оценить изменения числа различных изоформ α-субъединицы Na/K-АТФазы в модели МФТП- индуцированного паркинсоноподобного синдрома у крыс. Материал и методы Работа выполнена на 28 аутбредных крысах линии Вистар (самцы, средний вес 250 г). Содержание животных и использо- ванные процедуры соответствовали биоэтическим требованиям Декларации ЕС (Declaration ES 2010). Животные были разделены на 2 группы: контрольные живот- ные (n=14) и экспериментальные (n=14). Экспериментальным крысам однократно, интраназально, вводили нейротоксин МФТП (Sigma Chemical Co., США). Для этого МФТП растворя- ли в физиологическом растворе (0,9% NaCl) в концентрации 20 мг/мл. Крыс фиксировали, а нос поднимали вертикально. Полученный раствор нейротоксина с помощью микропипетки вводили в каждую ноздрю в дозировке 1 мг/ноздря. Интервал между введениями составлял 1 минуту, чтобы не затруднять дыхание животного. Контрольным крысам вместо МФТП вво- дили физиологический раствор эквивалентного объема. Спустя 16 дней крыс декапитировали, и на холоде извлекали следующие структуры мозга: обонятельные луковицы, фрон- тальную кору, моторную кору, зрительную кору, мозжечок, гиппокамп, миндалины, стриатум и гипоталамус. Выделенные структуры замораживали в жидком азоте и хранили при -70 ˚С. После стандартной подготовки образцов методом Western Blotting [7] детектировали α-субъединицы Na/K-ATФазы в различных отделах мозга крыс. Электрофоретический ана- лиз проводили в камере для вертикального электрофореза фирмы «Bio Rad» (США) при постоянной силе тока (40 мА на один гель). Хемилюминесценцию регистрировали в приборе ChemiDoc XRS+ фирмы «Bio Rad», регистрировали накопление сигнала каждые 2 секунды в течение 2 минут. Для построе- ния графиков использовали значения уровня люминисценции (в условных единицах) полос α-субъединиц, нормированные на значения уровня люминсценции полос GAPDH, использо- вавшейся в качестве контроля нанесения. Статистическую обработку результатов проводили с исполь- зованием непараметрического критерия Манна–Уитни в ком- пьютерной программе «Statistica 8.0». Результаты При физическом осмотре и наблюдении за крысами в арене «Открытого поля» моторных нарушений не было выявлено ни у одного из животных, получавших нейротоксин. Интраназальное введение МФТП крысам в целом оказало раз- нонаправленное влияние на количественное распределение всех трех α-субъединиц Na/K-ATФазы в некоторых структурах голов- ного мозга крыс. Выявлено значимое уменьшение, относительно контрольных значений, числа α1-субъединиц Na/K-ATФазы (рис. 1) во фронтальной коре (p<0,05) и мозжечке (p<0,05). В стриатуме, напротив, значимое увеличение данной субъединицы (p<0,05). Число α2-субъединиц Na/K-ATФазы (рис. 2) значимо снижалось относительно контроля в таких структурах мозга, как обонятельные луковицы (p<0,05), моторная кора (p<0,05) и гиппокамп (p<0,01). Введение нейротоксина значимо увеличило, относительно контроля, число α3-субъединиц Na/K-ATФазы (рис. 3) в обонятельных луковицах (p<0,05), фронтальной коре (p<0,05), зрительной коре (p<0,01) и мозжечке (p<0,05). Наиболее выраженные изменения в виде одновременного снижения числа α1- и увеличения α3- субъединиц Na/K-ATPазы произошли во фронтальной коре и мозжечке. В обонятельных луковицах аналогичный сдвиг произошел между α2- и α3- субъ- единицами. Общая картина изменений характеризуется прео- бладанием α3-субъединиц над остальными двумя изоформами. Обсуждение Интраназальное введение МФТП крысам оказало влияние на один из фундаментальных механизмов, регулирующих ионный состав клетки и вносящих вклад в ее мембранный потенциал – Na/K-ATФазу. Снижение экспрессии двух α-субъединиц и пре- обладание одной α-субъединиц согласуется с исследованиями, в которых обнаружены как положительные, так и отрицатель- ные связи между экспрессией α-субъединиц [8]. Известно, что изоформы α-субъединиц, выполняющие каталитическую функцию, обладают различным сродством к ионам К+ и Na+ [9]: α1-субъединице (экспрессируется во всех типах клеток) присуще высокое сродство к ионам К+ , α2-субъединице (экс- прессируется в астроцитах) присуще низкое сродство к ионам К+. Функциональная активность этих субъединиц обеспечивает депонирование ионов К+ в состоянии покоя и высокой актив- ности нейронов. Третья α3 субъединица (экспрессиурется в аксонах и дендритах нейронов) обладает низким сродством к Na+ и обеспечивает клиренс иона в активно-возбуждающихся нейронах. Принимая во внимание свойства перечисленных субъединиц, нами сделан вывод, что под действием МФТП, преимущественно в корковых структурах головного мозга крыс, сформировался способствует увеличению внеклеточной концентрации К+ и снижению внутриклеточной концентрации Na+. Такое изменение градиентов концентрации способно изменить проницаемость мембраны нейронов для соответствующих ионов и сдвинуть потенциал покоя нейронов в сторону положительных значений. Это в свою очередь способно оказать негативное воздейст- вие на спайковую активность нейронов. Кроме этого α1- и α2-субъединицы вовлечены в удаление избыточного глутамата из синаптической щели, и нарушение этого процесса может способствовать эксайтотоксичности данного медиатора [10]. С другой стороны, выявленный профиль экспрессии субъединиц Na/K-ATФазы может носить и компенсаторный характер как ответ на оксидативный стресс и гибель нейронов. Поскольку, α3-субъединица имеет повышенное сродство с α-синуклеином, это может способствовать его агрегации на мембранах нейронов [11]. Перечисленные изменения, выявлен- ные во фронтальной коре, гиппокампе и стриатуме, согласуются с вышеупомянутыми работами, в которых интраназальное вве- дение МФТП крысам нарушило выработку инструментальных рефлексов и для которых указанные структуры играют ключе- вую роль [12]. Нарушение ионного баланса и эксайтотоксич- ность глутамата на фоне окислительного стресса в гиппокампе являются факторами, провоцирующими экспрессию генов, Обонятельная дисфункция – это один из ранних призна- ков БП, который возникает раньше, чем моторные и когни- тивные нарушения [15, 16]. Обнаруженные нами изменения α-субъединиц Na/K-ATФазы в обонятельных луковица, до раз- вития двигательных нарушений подтверждает, что методика интраназального введения МФТП крысам является методикой формирования латентного периода БП. Заключение Интраназальное введение МФТП крысам приводит к разно- направленному изменению экспрессии α-субъединиц Na/K- ATФазы в головном мозге крыс. Установившийся под действием нейротоксина профиль экспрессии субъединиц Na/K-ATФазы гипотетически способен нарушить ионный баланс в межкле- точной и экстраклеточной средах головного мозга и оказать влияние на возбудимость нейронов в различных структурах, в т.ч. и ответственных за обучение.